Konstruktion, Charakterisierung und Optimierung des synthetischen, sekundären Chromosoms synVicII in Escherichia coli

Synthetische, sekundäre Chromosomen sind ein wertvolles Werkzeug, um Chromosomenorganisationssysteme zu untersuchen. Anhand ihres Designs, ihrer Assemblierung und ihrer Charakterisierung können auch wichtige Konstruktionsregeln für synthetische Chromosomen abgeleitet werden. In der Biotechnologie könnten außerdem synthetische, sekundäre Chromosomen genutzt werden, um Mikroorganismen genetisch zu verändern. Für alle Anwendungen ist es wichtig, dass das verwendete synthetische, sekundäre Replikon gut charakterisiert und beschrieben worden ist. In dieser Arbeit wurde das synthetische, sekundäre Chromosom synVicII im monochromosomalen Bakterium Escherichia coli etabliert und charakterisiert. Als Vorbild für synVicII diente das natürlich vorkommende sekundäre Chromosom II von Vibrio cholerae, einem Bakterium, welches zwei unterschiedlich große Chromosomen besitzt. So wurden der Replikationsursprung des zweiten V. cholerae Chromosoms oriII, das Initiatorgen rctB und das eigene Chromosomen II Segregationssystem parABII in synVicII integriert. Transformation in E. coli bewies, dass synVicII erfolgreich in E. coli replizieren kann. Für die effiziente Assemblierung, Modifizierung und den Transfer von synVicII wurden verschiedene Elemente eingebaut: Beispielsweise macht ein integrierter oriT synVicII konjugierbar, ein Hefereplikationsursprung und ein Selektionsmarker erlauben die Assemblierung in S. cerevisiae und eine Flp-FRT-Kassette erlaubt die Entfernung von nur für die Konstruktion wichtigen Elementen. SynVicII wurde ModularCloning kompatibel entwickelt, sodass schnell und effizient neue DNA-Sequenzen eingebaut werden können. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde synVicII auf wesentliche Charakteristika bakterieller Chromosomen wie die Stabilität, die Kopienzahl und die genetische Integrität untersucht. Mit einem neu entwickelten Durchflusszytometrie-basierten Stabilitätstest konnte gezeigt werden, dass synVicII deutlich stabiler als ein oriC-basiertes Replikon, synEsc, ist. Ein Plattentest bestätigte die mit dem neu entwickelten Durchflusszytometrie-basierten Stabilitätstest bestimmte Replikonverlustrate von synVicII. Der Plattentest demonstrierte auch, dass synVicII instabiler als ein 100 % stabiles synF-Plasmid ist. Mit einem neu entwickelten Evolutionsexperiment konnten neue stabilere synVicII-Varianten entwickelt und identifiziert werden. synVicII besitzt in E. coli eine vergleichbar niedrige Kopienzahl relativ zu oriC, was anhand von qPCR und Microarray-Analysen geklärt werden konnte. Die Kopienzahl-Analyse deutete sogar darauf hin, dass synVicII in E. coli ähnlich wie das zweite Chromosom in V. cholerae repliziert. Demnach startet synVicII vermutlich später die DNA-Replikation als das E. coli Chromosom. Southern Blot Analysen demonstrierten, dass synVicII im Gegensatz zu synEsc nicht in das E. coli Chromosom integriert. Neben sekundären Chromosomen könnten auch noch zusätzlich tertiäre Chromosomen in der Biotechnologie zum Einsatz kommen. Deswegen wurde die Diversität der sekundären Chromosomen von Vibrionaceae untersucht. Marker-Frequency-Analysen deuten darauf hin, dass alle sekundären Chromosomen in den 11 untersuchten Vertretern der Vibrionaceae die DNA-Replikation später initiieren als das erste Chromosom und beide Chromosomen zusammen terminieren. Neun neue synthetische Chromosomen mit verschiedenen Vibrionaceae Replikationsursprüngen wurden assembliert und ihre Eignung als tertiäres Chromosom initial getestet. Mit Konjugationstests wurde demonstriert, dass alle verwendeten Vibrionaceae Replikationsursprünge untereinander nicht kompatibel sind. Zusammengefasst besitzt synVicII mit seinen bisherigen charakterisierten Chromosomeneigenschaften schon großes Potenzial, um in der Grundlagenforschung und Biotechnologie eingesetzt werden zu können

Konstruktion synthetischer sekundärer Chromosomen zur Charakterisierung von DNA-Reparatur und Segregation in Escherichia coli

Alle Funktionen einer jeden Zelle sind im Genom kodiert, dieses wird in jeder Zellteilung – egal ob ein oder mehrere Chromosomen – gleich auf die Tochterzellen verteilt. Die Integrität des Genoms ist für das Überleben eines jeden Organismus essentiell. Durch die Methoden der Synthetischen Biologie werden umfangreiche Veränderungen an Genomen durchgeführt bzw. ganze Chromosomen synthetisiert, wobei der Fokus meist auf den kodierenden Sequenzen liegt. Chromosomen sind aber mehr als eine Aneinanderreihung von Genen. Chromosomen benötigen Systeme zur Replikation, Segregation, Organisation und Reparatur, was häufig über Wechselwirkungen von Proteinen mit DNA-Sequenzmotiven geschieht. Die vorliegende Arbeit studiert solche, als Chromosome Maintenance System bezeichnete Prozesse anhand von synthetischen sekundären Chromosomen in E. coli. Können die resultierenden Ergebnisse zum Verständnis der DNA-Replikation in Bakterien beitragen? Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte synthetische sekundäre Chromosom (synVicII) repliziert in E. coli wie das sekundäre Chromosom in V. cholerae, auf dem es basiert. Das Design wurde nach einer initialen Charakterisierung weiter optimiert. Ein entscheidender Schritt war die Herstellung einer Kompatibilität von synVicII mit dem hierarchischen DNA-Assemblierungssystem MoClo. Parallel wurde eine Vorgehensweise etabliert, um hochvariable, lange DNA-Sequenzen zu generieren, in denen benutzerdefinierte DNA-Sequenzen ausgeschlossen werden können. Die Insertion dieser DNA-Sequenzen in synVicII ermöglicht es, synthetische sekundäre Chromosomen mit einer Größe von 100 kb zu konstruieren. Dadurch konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit erstmals die Interaktion der DNA-Segregation und DNA mismatch Reparatur in vivo durch ein Set von drei synthetischen sekundären Chromosomen analysiert werden. Beide Prozesse sind auf das Vorhandensein hemi-methylierter GATC-Sequenzen angewiesen und die Arbeit zeigt, dass durch eine strukturierte GATC-Anordnung ein differenzielles Binden der beiden Proteine SeqA und MutH erreicht werden kann. Da die Funktionsweise von SeqA noch nicht vollständig verstanden ist, wurde außerdem das quantitative Verständnis von SeqA experimentell verbessert. Anhand der Daten wurde ein Modell der SeqA-Strukturen an den Replikationsgabeln generiert. Durch FRAP-Experimente konnte belegt werden, dass SeqA ein dynamisches Protein ist, welches zwischen zwei Bindeereignissen frei in der Zelle diffundiert. SeqA und Dam konkurrieren um die hemi-methylierten GATCs. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteine in einem konstanten Mengenverhältnis vorliegen. Dies könnte ein möglicher Aspekt zur Regulation der Re-methylierung der GATC-Sequenzen in E. coli sein. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen dadurch signifikant zum Verständnis der DNA-Replikation in Bakterien bei

The Role of Genomic Context in Bacterial Growth Homeostasis

The growth of bacteria is a complex but well-orchestrated dance involving the repetitive and reproducible production of their diverse cellular components in order to divide. A lot can go astray and therefore the cell has developed several strategies in order to ensure everything remains synchronized. This problem is only further complicated as the cells adjust their growth rate to their living conditions resulting in ripple effects throughout the cell physiology. One notable change is that as nutrient availability and quality increases so too does the average size and the concentration of ribosomes in the cell. The latter enables the production of the largest macromolecule faction in the cell (proteins) including the production of more ribosomes required to maintain the protein synthesis requirements. With the increase in volume of the cell comes a required increase in surface area, and a disbalance between these two would result in untenable levels of internal pressure. How then do bacteria ensure that volume growth is synchronized with the production of cell envelope components so that cell homeostasis is maintained, especially in the face of fluctuating growth rate? Genomic context is known to assist in co-regulation of genes thereby synchronizing them to respond to different cellular stimuli. As the bacterial genome is highly fluid, the existence of conserved genomic contexts suggests important loci of co-regulation. Could it be in these gene clusters that a possible link between growth and surface expansion is found? To answer this question this thesis undertook three missions, firstly we established a genome comparison tool (www.GenCoDB.org) that will take advantage of the ever-growing availability of bacterial genomes to assist us in the analysis, comparison, and quantification of genome contexts. This will rely on novel strategies in order to: accommodate the breadth of genome data available in a computationally efficient manner, reduce the effect of sampling bias that plague most bacterial datasets and ensure candidates are considered significant for their evolutionary context. The availability of GenCoDB is sure to facilitate genomic context research in the microbiology community and improve accessibility to non-bioinformatics to this wellspring of important biological data. With the swath of genomic neighbourhood data, we then sought to understand and analyse the evolution of conserved gene clusters in order to narrow down possible volume-surface regulating candidates. By tracking the evolution of gene clusters throughout the Bacteria kingdom we found that co-orientation is strongly conserved, however, this does not influence the subsequent context around the cluster nor the expansion of the cluster. We found that vertical transmission and not horizontal gene transfer was found to be the driving factor of gene cluster occurrence in chromosomes and that the origin and terminus are hotspots for cluster maintenance. Finally, we found that despite the apparent frequency of operon organization in gene clusters, gene clusters appear to be maintained due to other selective pressures such as within-cluster protein-protein interactions and the essential status of their genes. We suggest that operons are a consequence and not a cause co-localization over evolutionary time. We identified a single gene cluster candidate that met all the requirements we believe are required for cell growth homeostasis of synchronized surface and volume expansion. These requirements were a broad conservation within Bacteria, and a connection between ribosome-associated proteins (growth) with cell envelope synthesizes. In agreement with our evolution studies we found that whilst the cluster was co-regulated this did not appear to be the selective pressure that brought these different processes together. Instead we found a potential role of genomic channelling, linking the production of pyrimidines with the synthesis of the cell envelope which is reliant on the co-localization of this cluster. Together, this work will forward the understanding of chromosome evolution in Bacteria and the potential implications of genomic context in metabolite utilization. It challenges the roles that operons and horizontal gene transfer play in the long-term evolution of gene order and it provides a new quantitative and statistical resource providing access to over 1.9 million gene neighbourhoods

Charakterisierung der DNA-Replikation beider Chromosomen von Vibrio cholerae durch Methoden der Genomik und synthetischen Biologie

Vibrio cholerae ist aufgrund der Aufteilung seines Genoms auf zwei Chromosomen ein bekannter Modellorganismus für Bakterien mit mehrteiligen Genomen. Der Replikationsursprung des zweiten Chromosoms, ori2, bildet eine ideale Grundlage für die Entwicklung eines synthetischen sekundären Chromosoms in monochromosomalen Bakterien wie E. coli. Die Regulation der Initiation der DNA-Replikation, vor allem des zweiten Chromosoms, und die Koordination der Replikation beider Chromosomen in V. cholerae sind jedoch noch immer nicht vollständig verstanden. Diese Arbeit soll einen Beitrag zur Erweiterung dieses Verständnisses leisten. Die Koordination der Replikation von Chr1 und Chr2 in V. cholerae erfolgt durch die chr2 replication triggering site crtS auf Chr1, da Replikation der crtS die Initiation der DNA-Replikation an ori2 induziert (Val et al. 2016). Die Kopienanzahl ori2-basierter Replikons, wie des synthetischen sekundären Chromosoms synVicII, ist in E. coli nach Integration der crtS in das Hauptchromosom erhöht. Dieser Effekt konnte genutzt werden, um die Funktionsfähigkeit der crtS verschiedener V. cholerae-Stämme zu untersuchen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die crtS in den Vibrionaceae konserviert ist. Die crtS und ori2 verschiedener Vibrionaceae sind in E. coli bis auf wenige Ausnahmen kompatibel. Zusätzlich zeigten alle untersuchten Vibrionaceae sowohl den aus V. cholerae bekannten Replikationsverlauf ori1-crtS-ori2 als auch eine zeitgleiche Termination der Replikation beider Chromosomen. Weiterhin konnte eine Methode zur Synchronisation der DNA-Replikation in V. cholerae durch Serinhydroxamat (SHX) etabliert werden. Im Zuge dessen wurde der verwendete Stamm V. cholerae A1552 vollständig sequenziert und annotiert. Behandlung von V. cholerae mit SHX führt zur Induktion der Stringent Response (SR) (Haralalka et al. 2003). Im Gegensatz zu E. coli zeigt V. cholerae während der SR einen genau definierten Ablauf von Zellteilungen und Re-Initiationen der DNA-Replikation. Dieser Ablauf wird durch die SR-induzierte Proteinbiosynthese und damit verbundenem Zellwachstum gesteuert und ist somit abhängig von der Produktion des Alarmons (p)ppGpp und dessen Regulation der Transkription. Zudem ist er von der verwendeten SHX-Konzentration abhängig, was sowohl experimentell als auch mittels eines mathematischen Modells gezeigt werden konnte