Control of directionality in the DNA strand-exchange reaction catalysed by the tyrosine recombinase TnpI

In DNA site-specific recombination catalysed by tyrosine recombinases, two pairs of DNA strands are sequentially exchanged between separate duplexes and the mechanisms that confer directionality to this theoretically reversible reaction remain unclear. The tyrosine recombinase TnpI acts at the internal resolution site (IRS) of the transposon Tn4430 to resolve intermolecular transposition products. Recombination is catalysed at the IRS core sites (IR1–IR2) and is regulated by adjacent TnpI-binding motifs (DR1 and DR2). These are dispensable accessory sequences that confer resolution selectivity to the reaction by stimulating synapsis between directly repeated IRSs. Here, we show that formation of the DR1–DR2-containing synapse imposes a specific order of activation of the TnpI catalytic subunits in the complex so that the IR1-bound subunits catalyse the first strand exchange and the IR2-bound subunits the second strand exchange. This ordered pathway was demonstrated for a complete recombination reaction using a TnpI catalytic mutant (TnpI-H234L) partially defective in DNA rejoining. The presence of the DR1- and DR2-bound TnpI subunits was also found to stabilize transient recombination intermediates, further displacing the reaction equilibrium towards product formation. Implication of TnpI/IRS accessory elements in the initial architecture of the synapse and subsequent conformational changes taking place during strand exchange is discussed

Le système de recombinaison site-spécifique TnpI/IRS du transposon Tn4430

Le transposon Tn4430 appartient à la famille de Tn3 et contient un système de recombinaison particulier qui a pour fonction de résoudre les intermédiaires générés par le mode de transposition réplicatif de cet élément. La réaction de recombinaison site-spécifique est catalysée par la recombinase TnpI, appartenant à la famille des recombinases à tyrosine, au niveau du site de résolution interne (IRS). Ce site possède 4 motifs de fixation pour la recombinase TnpI. Lors de la première partie de ce travail, des expériences réalisées in vivo et in vitro ont démontré que les deux motifs inversés IR1 et IR2 constituent le site coeur de recombinaison où se produisent la coupure et l'échange des quatre brins d'ADN. Les deux motifs de fixation supplémentaires, DR1 et DR2, sont des éléments accessoires répétés en orientation directe en aval du site coeur. Ces séquences ne sont pas nécessaires pour permettre à une réaction de recombinaison de se produire mais interviennent afin de stimuler l'activité de recombinaison et contrôler la direction de la réaction. En effet, les séquences accessoires DR1 et DR2 contraignent la réaction de recombinaison en favorisant les événements entre deux sites en orientation directe sur la même molécule d'ADN (mécanisme de résolution sélective). Le produit de la réaction entre deux sites IRS possède une topologie unique d'un caténat à deux croisements. Ces résultats démontrent que les motifs accessoires DR1 et DR2 interviennent dans la formation d'un complexe nucléoprotéique de structure déterminée où les sous-unités de TnpI jouent un rôle catalytique au niveau des motifs du site coeur et architectural au niveau des séquences accessoires DR1 et DR2. La contribution relative du site coeur IR1-IR2 et des séquences accessoires DR1-DR2 dans la progression de la réaction de recombinaison du système TnpI/IRS a été analysée lors de la seconde partie de ce travail. L'activité de recombinaison du site coeur a tout d'abord été comparée à celle obtenue avec un site rendu parfaitement symétrique, en présence et en absence des sites accessoires. Ces études ont démontré que la présence des sites accessoires est suffisante pour assurer de la résolution sélective, indépendamment de l'orientation relative des deux sites coeurs et de la séquence de la région centrale. La réaction d'échange de brins a ensuite été analysée en bloquant la réaction de recombinaison par l'utilisation de peptides inhibiteurs et en identifiant les brins échangés dans l'intermédiaire en jonction de Holliday. L'étude des jonctions de Holliday formées en présence des sites coeurs de recombinaison indique que la TnpI est capable de couper et échanger les deux brins d'ADN. Ce résultat démontre que le site coeur IR1-IR2 n'a peu ou pas d'influence sur la direction de la réaction. Par contre, la présence des séquences accessoires impose un ordre strict à la réaction d'échange des brins d'ADN. La contrainte imposée par ces régions accessoires a été analysée en changeant l'orientation du site coeur par rapport aux motifs accessoires. Ces données démontrent que les sous-unités catalytiques de TnpI sont positionnées dans une géométrie déterminée grâce à l'assemblage du complexe TnpI/IRS.Doctorat en sciences (sciences biologiques) (BIOL 3)--UCL, 200

Self-control in DNA site-specific recombination mediated by the tyrosine recombinase TnpI.

Tn4430 is a distinctive transposon of the Tn3 family that encodes a tyrosine recombinase (TnpI) to resolve replicative transposition intermediates. The internal resolution site of Tn4430 (IRS, 116 bp) contains two inverted repeats (IR1 and IR2) at the crossover core site, and two additional TnpI binding motifs (DR1 and DR2) adjacent to the core. Deletion analysis demonstrated that DR1 and DR2 are not required for recombination in vivo and in vitro. Their function is to provide resolution selectivity to the reaction by stimulating recombination between directly oriented sites on a same DNA molecule. In the absence of DR1 and/or DR2, TnpI-mediated recombination of supercoiled DNA substrates gives a mixture of topologically variable products, while deletion between two wild-type IRSs exclusively produces two-noded catenanes. This demonstrates that TnpI binding to the accessory motifs DR1 and DR2 contributes to the formation of a specific synaptic complex in which catalytically inert recombinase subunits act as architectural elements to control recombination sites pairing and strand exchange. A model for the organization of TnpI/IRS recombination complex is presented

the tyrosine recombinase TnpI

strand-exchange reaction catalysed b