The B-cell antigen receptor signals through a preformed transducer module of SLP65 and CIN85

The Slp65 adaptor molecule is important for B-cell receptor signalling. Here, the interactomes of SLP65 in resting and activated B cells are resolved by mass spectrometry. A number of SLP65 interacting partners, including CIN85, continuously associate with SLP65 in a stimulation-independent manner. CIN85 recruits SLP65 to the membrane and it is required for SLP65 phosphorylation

CIN85/CD2AP-basierte Proteinkomplexe in der B-Zell Antigen Rezeptor Signalleitung

Die frühe B-Zell Antigen Rezeptor (BZR) Signalleitung ist charakterisiert durch die Bildung multimerer Proteinkomplexe und deren Rekrutierung in BZR-reiche Domänen der Plasmamembran. Ein solcher Membran-assoziierter Signalkomplex ist der Ca2+- Initiationskomplex, der sich um das zentrale Adaptorprotein SH2-domain-containing leukocyte protein of 65kDa (SLP65) formiert. Um den Mechanismus der Plasmamembranlokalisation von SLP65 weiter zu entschlüsseln, wurde in unserer Gruppe das SLP65 Interaktom analysiert. Dadurch konnten die Adaptorproteine Cbl-interacting protein of 85kDa (CIN85) und CD2-associated protein (CD2AP) als konstitutive Interaktionspartner von SLP65 identifiziert werden. Weitere Studien zeigten, dass die Verhinderung dieser Interaktion durch eine Veränderung der Bindemotive in SLP65 zu einer verminderten BZR-induzierten Ca2+ Mobilisierung in DT40 und primären, murinen B Zellen führte. Somit ergaben sich folgende Fragen für diese Arbeit: Resultiert das Ausschalten von CIN85 und CD2AP in einem Defekt in der Ca2+ Mobilisierung – wie von SLP65 Seite gezeigt, und bilden CIN85, CD2AP und SLP65 somit einen präformierten Signaltransduktionskomplex? Wie unterstützen CIN85 und CD2AP die Funktion von SLP65 in der BZR Signalleitung? In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass CIN85 den Beginn und die Stärke der Ca2+ Mobilisierung in DT40 B Zellen positiv reguliert. Allerdings kann CD2AP diese Funktion von CIN85 teilweise ersetzen. Durch Konfokalmikroskopie lebender Zellen konnte ich zeigen, dass CIN85 und CD2AP nach BZR-Stimulation zur Plasmamembran rekrutiert werden, aber dafür unterschiedliche Verankerungsmechanismen benutzten. Interessanterweise, waren genau die Domänen in CIN85, die essentiell für die Ca2+ Mobilisierung waren, auch nötig für dessen Plasmamembranlokalisation. Eine genauere Analyse der Membranlokalisierung durch Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie ergab, dass CIN85 nach BZR-Stimulation mit BZR-reichen Mikroclustern kolokalisiert. Im Gegensatz zu CIN85 konnten nur sehr wenige CD2AP Moleküle in diesen Mikroclustern gefunden werden. Wichtig in diesem Zusammenhang ist, dass die Präformation von CIN85 und SLP65 durch direkte BCR-Lokalisation von SLP65 umgangen werden konnte. Dies impliziert, dass CIN85 und SLP65 einen präformierten BZR-Signalleitungskomplex bilden. In diesem Komplex bringt CIN85 SLP65 direkt in die BZR-reichen Mikrocluster und ermöglicht somit eine effiziente BZR-induzierte Ca2+ Antwort. Zusammengefasst, tragen die hier dokumentierten Ergebnisse zum Verständnis der B-Zell Aktivierung insbesondere BZR-proximaler Signalkomplexe und deren Wichtigkeit in der Weiterleitung von BZR-Signalen bei