Conservation genetics of the critically endangered Montseny brook newt (Calotriton arnoldi)

El tritó del Montseny (Calotriton arnoldi) és un dels vertebrats més amenaçats d'Europa i està classificat com en perill crític per la IUCN. Aquesta espècie és endèmica del Parc Natural del Montseny (NE de la Península Ibèrica) i es distribueix en set torrents propers geogràficament (superfície total de 8 km2). El seu hàbitat està fragmentat en dos sectors principals (oriental i occidental) a banda i banda de la vall del riu Tordera. El cens actual poblacional ha estat estimat en menys de 1.500 individus adults. L'objectiu principal d'aquesta tesi és proporcionar coneixements bàsics sobre la genètica del tritó del Montseny perquè siguin útils per a la conservació de l'espècie. Així, s’ha explorat la biogeografia de l’espècie (Capítol 1), s’ha dissenyat nous marcadors microsatèl·lits polimòrfics (Capítol 2), s’ha caracteritzat i estudiat l'estructura genètica de les seves poblacions (Capítol 3) i s’ha avaluat el programa ex situ (capítol 4 ), mitjançant l'anàlisi de dos gens, un mitocondrial i un nuclear, juntament amb 24 marcadors microsatèl·lits. Així, confirmem la validesa de les dues espècies de Calotriton. Malgrat que el rang de distribució del tritó del Montseny és limitat, C. arnoldi presenta un alt grau d’estructuració genètica. Les anàlisis morfològiques i moleculars suggereixen dos grups poblacionals geogràficament diferents, sense flux genètic entre ells, l'oriental i l'occidental. Els quinze loci polimòrfics descrits en aquesta tesi, juntament amb els nou loci que s'han desenvolupat prèviament per a C. asper que han amplificat amb èxit a C. arnoldi, han proporcionat una poderosa eina per als estudis de genètica de la conservació. La fragmentació de l'hàbitat natural d'aquesta espècie s'ha traduït en una forta divisió de genètica de les poblacions en els dos sectors, sense migració detectable entre ells. Tot i que les estimacions de la mida efectiva de la població suggereixen valors críticament baixos per a totes les poblacions, no presenta evidència d'alts nivells d'endogàmia. Per tant, els nivells de diversitat genètica de C. arnoldi són comparables a altres espècies d'amfibis amb rangs de distribució molt més gran. Aquesta és una de les poques espècies en què la fragmentació de l'hàbitat no mostra efectes negatius en una escala de temps evolutiu. Aquesta espècie pot evolucionar a través d'estratègies de reproducció (per exemple, l'elecció de parella o mate choice) per fer front a les seves poblacions petites. No obstant això, s’adverteix que l’efecte de la fragmentació dels hàbitats naturals ha de ser considerats de manera independent a la pèrdua o degradació de l'hàbitat en les estratègies de planificació per a la conservació d'espècies. La forta estructura genètica observada suggereix que tots dos sectors han de ser considerats com dues unitats de gestió independents per a la conservació, tant in situ com ex situ. En termes de conservació ex situ, es conclou que, la diversitat genètica actual de les poblacions captives i la seva representativitat són bones, però no òptimes. Es suggereix que s’hauria d’incorporar nou material genètic en les poblacions captives, a través de la introducció de nous individus no relacionats o del seu esperma. Es recomana mantenir les dues línies de cria de forma independent i evitar el creuament entre elles. A més, es recomana mantenir un programa de cria obert per permetre el flux de gens de les poblacions in situ cap a les poblacions captives per tal d’evitar l'adaptació a la captivitat a les generacions successives. El coneixement proporcionat en aquesta tesi és rellevant per a la conservació i gestió de tritó del Montseny; aquesta ha estat molt útil per augmentar el coneixement en la dinàmica poblacional de l'espècie i proporcionar estratègies i recomanacions que s'han que tenir en compte en el pla de conservació.The Montseny brook newt (Calotriton arnoldi) is one of the most endangered vertebrates in Europe and it is classified as critically endangered by the International Union for Conservation of Nature (IUCN). This species is endemic to the Montseny Natural Park (NE Iberian Peninsula) distributed in seven geographically close brooks, occupying a total area of 8 km2. Moreover, its habitat is fragmented into two main sectors (eastern and western) on both sides of the Tordera river valley. The current census population size of this species has been estimated at less than 1500 adult individuals. The main goal of this thesis is to provide basic knowledge about the genetics of the Montseny brook newt to contribute towards the conservation of this emblematic species. To achieve this goal, we have explored the biogeography of the species (Chapter 1), the design of polymorphic markers (Chapter 2), the characterization and genetic structure of its populations (Chapter 3) and the ex situ reproductive program (chapter 4) by analyzing sequence data of two genes, one mitochondrial and one nuclear, together with 24 microsatellite markers. Within this thesis, we confirm the validity of the two species of Calotriton. Despite the limited distribution range of the Montseny brook newt, C. arnoldi presents a high genetic structure. The morphological and molecular analyses suggest two geographically distinct population groups, to the east and west of the Tordera river valley, with no gene flow between them. The fifteen polymorphic loci described in this thesis, together with nine loci previously developed for C. asper that successfully cross-amplified in C. arnoldi, provided a powerful tool for the conservation genetics studies presented in this Thesis. The fragmentation of the species’ natural habitat has resulted in a strong genetic division of population in two sectors, with no detectable migration between them. Although estimates of effective population size suggest critically low values for all populations, no evidence of high levels of inbreeding was found. Thus, the levels of genetic diversity of C. arnoldi are comparable to other amphibian species with much larger distribution ranges. This is one of the few species in which habitat fragmentation does not seem to have had a negative effect on an evolutionary time scale. It is suggested that this species could have developed reproductive strategies (eg, mate choice) to deal with their small populations. However, it is warned that the effect of fragmentation of natural habitats should be considered independently than habitat loss or degradation in planning strategies for the conservation of endangered species. The strong genetic structure observed in this species suggested that both sectors should be considered as two separate management units for conservation, both in situ and ex situ. In terms of ex situ conservation, it is concluded that, currently, the genetic diversity of captive populations and its representativeness are good but not optimal. New genetic material should be incorporated into the captive stock through the introduction of new unrelated individuals or their sperm. It is strongly recommended to maintain the two different breeding lines independently to avoid cross-fertilization between them and consequently possible outbreeding depression effects. In addition, it is recommended to keep an open-program to allow in situ continuous gene flow to captive populations to avoid adaptation to captivity in successive generations. The knowledge provided by this research is relevant to the conservation and management of the Montseny brook newt; the genetic information has been of paramount importance to increase the knowledge of the population dynamics of C. arnoldi and to provide some strategies and recommendations to be considered in its conservation plan

El supervivent del massís del Montseny

Calotriton arnoldi és un tritó que viu exclusivament en el massís de Montseny. Amb un nombre molt baix de representants, aïllats en subpoblacions, caldria esperar que l'espècie presentés problemes genètics d'endogàmia. No obstant això, els estudis sobre "l'estat de salut" genètic d'aquesta espècie demostren que posseeix uns nivells de diversitat genètica similars als de la seva espècie germana, la qual té un rang de distribució molt major, així com uns nivells molt baixos de parentesc interpoblacional i d'endogàmia.Calotriton arnoldi es un tritón que vive exclusivamente en el macizo de Montseny. Con un número muy bajo de representantes, aislados en subpoblaciones, cabría esperar que la especie presentara problemas genéticos de endogamia. Sin embargo, los estudios sobre el "estado de salud" genético de esta especie demuestran que posee unos niveles de diversidad genética similares a los de su especie hermana, la cual tiene un rango de distribución mucho mayor, así como unos niveles muy bajos de parentesco interpoblacional y de endogamia.Calotriton arnoldi is a newt species which lives exclusively in the Montseny massif. With a very low number of representatives, isolated in subpopulations, one could expect the species to present genetic endogamy problems. However, studies investigating the genetic "health status" of the species show that it possess genetic diversity levels similar to those of the sister species, which has a wider distribution range. Moreover, the brook newt presents very low kinship relationships among populations as well as low levels of inbreeding

Integrative phylogeography of Calotriton newts (Amphibia, Salamandridae), with special remarks on the conservation of the endangered Montseny brook newt (Calotriton arnoldi).

The genus Calotriton includes two species of newts highly adapted to live in cold and fast-flowing mountain springs. The Pyrenean brook newt (Calotriton asper), restricted to the Pyrenean region, and the Montseny brook newt (Calotriton arnoldi), endemic to the Montseny massif and one of the most endangered amphibian species in Europe. In the present manuscript, we use an integrative approach including species distribution modeling (SDM), molecular analyses of mitochondrial and nuclear DNA sequence data and morphology to unravel the historical processes that have contributed to shaping the biogeography and genetic structure of the genus Calotriton, with special emphasis on the conservation of C. arnoldi. The results of the molecular analyses confirm that, despite having originated recently, being ecologically similar and geographically very close, there is no signal of hybridization between C. asper and C. arnoldi. SDM results suggest that tough environmental conditions on mountains tops during glacial periods, together with subsequent warmer periods could have prevented the contact between the two species. Within the critically endangered C. arnoldi, a high genetic structure is revealed despite its extremely small distribution range compared to C. asper. Haplotype networks, AMOVA and SAMOVA analyses suggest that two distinct groups of populations can be clearly differentiated with absence of gene flow. This is in concordance with morphological differentiation and correlates with its geographical distribution, as the two groups are situated on the eastern and western sides of a river valley that acts as a barrier. The genetic and morphological results are highly important for the ongoing conservation program of C. arnoldi and strongly justify the management of this species into at least two independent evolutionary significant units (eastern and western sectors) to guarantee the long-term population viability

Map showing the geographical distribution of Cyt <i>b</i> DNA haplotypes.

<p>(A) Pie diagram size indicates number of individuals. (B) Statistical parsimony networks showing cytochrome <i>b</i> haplotypes found for <i>Calotriton arnoldi</i> (left) and <i>C. asper</i> (right); circle size are proportional to haplotype abundance, straight lines and black dots reflect mutations and unsampled or extinct haplotype.</p

Discriminant canonical analysis scatterplot of males and females of <i>Calotriton arnoldi</i> from eastern and western sectors.

<p>Red squares and circles indicate eastern males and females, and blue squares and circles show western males and females, respectively. Black points are the mean values for each group.</p

Analysis of molecular variance (AMOVA) between <i>Calotriton asper</i> and <i>C. arnoldi</i>.

*<p>P<0.05, ** P<0.0001.</p

Weight coefficients of eight linear morphometric measurements for the two first canonic from discriminant analysis.

<p>Eigenvalues and percentage of accumulated variance are listed.</p

Linear morphometric variables used in the analysis of morphological differentiation of <i>Calotriton arnoldi</i>.

<p>Linear morphometric variables used in the analysis of morphological differentiation of <i>Calotriton arnoldi</i>.</p

Mitochondrial (Cyt <i>b</i>) and nuclear (RAG-1) DNA diversity statistics for <i>Calotriton asper</i> and <i>C. arnoldi</i>.

<p>Number of sequences (n), haplotypes (<i>h</i>) and variable sites (S), and nuclear (Π) and haplotype diversities (Hd). Standard deviations in brackets.</p

Spatial analysis of molecular variance (SAMOVA) and analysis of molecular variance (AMOVA) for <i>Calotriton arnoldi</i>.

*<p>P<0.05, ** P<0.0001</p><p>Two geographical groupings are showed corresponding to eastern and western sectors.</p