N011 Culture et délivrance au niveau du tissu cardiaque de cardiomyocytes issus de cellules souches embryonnaires humaines au moyen de matrices tridimensionelles poreuses à base de polysaccharides

Un intérêt particulier a été porté ces dernières années à la thérapie cellulaire réparatrice cardiaque. Les cellules souches embryonnaires humaines (hES) sont une source prouvée de cardiomyocytes et les premières données in vivo suggèrent leurs capacités fonctionnelles à type d’effet pacemaker ou réparatrices d’infarctus du myocarde. Nous avons étudié un mode de délivrance des cellules hES dans le tissu cardiaque basé sur une matrice 3D servant de support à la fois pour la culture des cellules et pour leur implantation au contact du myocarde.Des matrices poreuses de polysaccharides (pullulane et dextrane) ont été préparées par réticulation chimique permettant de réaliser des films avec des pores de 100 à 200 microns. Les matrices ont été recouvertes de différentes protéines; les cellules hES indifférenciées ont été cultivées sur fibroblastes murins, en milieu supplémenté avec du sérum knock-out et du FGF2. Dans une première partie in vitro, nous avons mis en évidence par q-RT-PCR, observation microscopique et imagerie confocale, la différenciation en cardiomyocytes de cellules hES directement cultivées dans les matrices en présence d’un milieu inducteur de différentiation; les matrices permettaient aussi la culture, l’expansion et la survie à long terme de parties battantes obtenues à partir de corps embryoïdes issus d’hES et isolées manuellement. Nous avons ensuite étudié le devenir des cellules hES dans un modèle de lésions cardiaques par dépôt de films poreux cellularisés sur les cœurs infarcis de souris NOD SCID. L’identification est confirmée pour les cardiomyocytes issus d’ES d’une lignée de cellules hES H9 GFP+ ainsi que d’une lignée de cellules hES dans laquelle l’expression de la GFP est sous contrôle d’un promoteur spécifique du tissu cardiaque, Nkx2.5. Nous avons ainsi mis en évidence la migration des cellules ES à différents stades de différenciation à partir des matrices 3D vers les souris NOD SCID ainsi que leur différenciation en cardiomyocytes. Les données de PCR quantitative sur la base du transgène GFP mettent en évidence une meilleure survie des ES délivrées par l’intermédiaire des matrices 3D en comparaison avec une administration directe. Une étude fonctionnelle comparative est en cours

MicroRNA-101 expression is associated with JAK2V617F activity and regulates JAK2/STAT5 signaling.

Philadelphia negative myeloproliferative neopl 28 asms (MPNs) are clonal haematological diseases characterized by excessive production of mature blood cells. Exome sequencing of patient samples have showed a relatively low degree genomic complexity for these diseases1. The majority of MPN patients carry somatic mutations in the JAK2 gene, with the JAK2V617F missense mutation being the most common in poly33 cythemia vera (PV, 95%) and essential thrombocythemia (ET, 60%) 2.FP was supported by Fondazione Umberto Veronesi, and Institute Pasteur - Fondazione Cenci Bolognetti

Quantitative assay for the detection of the V617F variant in the Janus kinase 2 (JAK2) gene using the Luminex xMAP technology

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The availability of clinically valid biomarkers contribute to improve the diagnosis and clinical management of diseases. A valine-to-phenylalanine substitution at position 617 (V617F) in the Janus kinase 2 (JAK2) gene has been recently associated with key signaling abnormalities in the transduction of haemopoietic growth-factor receptors and is now considered as a useful clinical marker of myeloproliferative neoplasms. Several methods have recently been reported to detect the JAK2 V617F point mutation and show variable sensitivity.</p> <p>Methods</p> <p>Using the Luminex xMAP technology, we developed a quantitative assay to detect the JAK2V617F variant. The method was based on polymerase chain reaction (PCR) followed by hybridization to specific probes coupled with internally dyed microspheres. The assay comprises 3 steps: genomic DNA extraction, end point PCR reaction, direct hybridization of PCR fragments and quantification. It has been tested with different sources of nucleic acid.</p> <p>Results</p> <p>Applied to whole blood samples, this quantitative assay showed a limit of detection of 2%. A highly sensitive allele-specific primer extension reaction performed in parallel allowed to validate the results and to identify the specimens with values below 2%.</p> <p>Conclusion</p> <p>Direct hybridization assay using the Luminex xMAP technology allows sensitive quantification of JAK2V617F from blood spots. It is simple and can be easily performed in a clinical setting.</p

Single-cell multi-omics identifies chronic inflammation as a driver of TP53-mutant leukemic evolution

Understanding the genetic and nongenetic determinants of tumor protein 53 (TP53)-mutation-driven clonal evolution and subsequent transformation is a crucial step toward the design of rational therapeutic strategies. Here we carry out allelic resolution single-cell multi-omic analysis of hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) from patients with a myeloproliferative neoplasm who transform to TP53-mutant secondary acute myeloid leukemia (sAML). All patients showed dominant TP53 ‘multihit’ HSPC clones at transformation, with a leukemia stem cell transcriptional signature strongly predictive of adverse outcomes in independent cohorts, across both TP53-mutant and wild-type (WT) AML. Through analysis of serial samples, antecedent TP53-heterozygous clones and in vivo perturbations, we demonstrate a hitherto unrecognized effect of chronic inflammation, which suppressed TP53 WT HSPCs while enhancing the fitness advantage of TP53-mutant cells and promoted genetic evolution. Our findings will facilitate the development of risk-stratification, early detection and treatment strategies for TP53-mutant leukemia, and are of broad relevance to other cancer types