Evolution du tissu osseux lors de l'exposition aux conditions de microgravite reelle ou simulee

SIGLEINIST T 73105 / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Modifications de facteurs vasoactifs et du réseau vasculaire intra-médullaire dans les métaphyses tibiales de rates ovariectomisées

ST ETIENNE-BU Sciences (422182103) / SudocSudocFranceF

Le strontium comme inhibiteur de l'adipogenèse et modulateur du statut redox des cellules souches mésenchymateuses

L ostéoporose liée à l âge se caractérise par une perte osseuse et une augmentation de l adiposité médullaire tout en s accompagnant d un stress oxydant général. L ostéoblaste et l adipocyte ont un précurseur commun, la cellule souche mésenchymateuse (CSM), dont la capacité à se renouveler et à se différencier est influencée par le statut redox cellulaire. Le Strontium (Sr) est un élément possédant un effet antifracturaire significatif in vivo cependant, il n affecte que peu les marqueurs d activités des cellules osseuses différenciées. Partant de ce constat, nous avons émis l hypothèse que les CSMs pouvaient être une cible cellulaire du Sr, et notamment que l inhibition de leur différenciation adipocytaire pouvait diminuer la lipotoxicité médullaire néfaste à la survie des ostéoblastes au cours du vieillissement. Nous montrons chez des souris traitées 3 semaines au Sr une diminution de l adiposité médullaire et une augmentation du volume osseux trabéculaire par rapport aux animaux témoins. Nos résultats démontrent que le Sr inhibe rapidement l adipogenèse des cellules multipotentes mésenchymateuses (CMMs) C3H10T1/2 en réprimant PPARg2 et l accumulation des gouttelettes lipidiques de façon partiellement dépendante de la voie ERK. Ce mécanisme serait dépendant de son effet proliférateur puisque que nous observons qu en présence de Sr plus la Cycline D1 est exprimée, plus PPARg2 est réprimé. De plus, le Sr prévient la mise en place de processus impliqués dans le statut redox cellulaire et nécessaires à la maturation d un adipocyte comme la biogenèse mitochondriale, l accumulation de Rac1 (une sous unité régulatrice de l activité de la Nadph oxydase) et l augmentation de l expression des enzymes antioxydantes. Nous montrons aussi que le Sr diminue la production d espèces réactives de l oxygène (ERO) de façon précoce ce qui pourrait expliquer son action anti-adipogénique. En effet, les ERO sont indispensables à l engagement des CSMs vers l adipogenèse et elles oxydent des lipides qui sont alors activateurs de PPARg. L ensemble de ces données nous montre que le Sr, en modifiant la production d ERO intracellulaire, maintiendrait un statut redox favorable à la prolifération des CMMs et défavorable à leur différenciation adipocytaire. Ainsi la capacité antioxydante et antiadipogénique de futures molécules pourraient définir de nouvelles approches dans le traitement de l ostéoporoseAge-related osteoporosis is associated with both an increased marrow adiposity while bone mass decreased and an increased oxidative stress. Mesenchymal stem cells (MSCs) differentiate into osteoblasts or adipocytes and their capacity of self-renewal and differentiation is influenced by cell redox status. Strontium (Sr) have an anti-fracture effect in vivo however, it doesn t clearly modulate markers of mature bone cell activities. Starting from this observation, we hypothesized that MSCs could be a cellular target of Sr, and particularly the inhibition of their adipocyte differentiation could reduce the marrow lipotoxicity which is deleterious for the osteoblast survival during aging. Our study showed that Sr-treated mice presented a lower medullary adiposity and a higher trabecular bone volume as compared to control animals. It was demonstrated that Sr rapidly inhibited adipogenesis of multipotent mesenchymal cells (MMCs) C3H10T1/2 by repressing PPARg2 and droplet lipid formation in a partially ERK-dependant pathway. This mechanism was linked to its proliferative effect since in presence of Sr the higher Cyclin D1 gene expression; the lower was that of PPARg2. Moreover, Sr prevented the establishment of processes involved in the cell redox status and necessary for the adipocyte maturation such as mitochondrial biogenesis, Rac1 protein accumulation (a NADPH oxidase regulatory subunit) and increase of the antioxidant enzyme expression. Sr also induced intracellular reactive oxygen species (ROS) decrease that could explain its anti-adipogenic action. Indeed, ROS are essential for the CSM commitment toward adipogenesis and they oxidize lipids which could in turn activate PPAR. Taken together, these data showed that Sr by modulating the intracellular ROS production maintained a redox status supporting the MMCs proliferation and preventing adipocyte differentiation. Thus, the antioxidant and anti-adipogenic capacities of future molecules could define new therapeutic approaches for osteoporosis treatmentST ETIENNE-Bib. électronique (422189901) / SudocSudocFranceF

Réponse des ostéoblastes à des stimulations physiques basées sur des contraintes mécaniques basses amplitudes hautes fréquences. Implication en ingénierie tissulaire

Les mécanismes par lesquels les charges mécaniques et électriques agissent sur le tissu osseux dans son ensemble, et sur les ostéoblastes, en particulier, sont encore mal compris. La réponse des ostéoblastes soumis à un seul type de stimulus physique a été comparée à celle obtenue par des combinaisons de plusieurs signaux mécaniques et/ou électriques. Dans la perspective d améliorer l ostéointégration des biomatériaux, nos études ont porté principalement sur les deux composants essentiels pour le succès de la greffe d un biomatériau : la matrice extracellulaire (MEC) qui sert d interface entre le biomatériau et l hôte ainsi que les facteurs angiogéniques. Nous avons étudié les réponses des ostéoblastes à des contraintes mécaniques complexes basées sur des signaux de basse amplitude haute fréquence (BAHF) appliquées à un modèle de culture 3D (hydroxyapatite macroporeux). Nous montrons donc qu une stimulation mécanique simple (3Hz) peut être potentialisée par des BAHF appropriées (25 Hz). Un dispositif a été développé pour appliquer des contraintes mécaniques très BAHF sur des modèles de culture 2D. La synthèse de la MEC est favorisée et ses propriétés ostéogéniques sont augmentées sous BAHF. Les BAHF n ont pas d effet sur le VEGF. Un autre dispositif a permis d appliquer un champ électrique aux cultures cellulaires. Quelques paramètres nous indiquent que les cellules perçoivent le champ électrique, mais nous retenons que le VEGF n est pas affecté. En revanche, la combinaison de ces stimulations physiques (contrainte mécanique très BAHF et champ électrique) augmente l expression de plusieurs facteurs impliqués dans l angiogénèse (VEGF, TGFb1, FGF2 ). Les sollicitations complexes définies dans cette thèse pourraient être un outil pour fonctionnaliser un substitut osseux cellulariséOver the course of a day, weight bearing bones experience numerous stimulations : mechanical loadings varying in magnitude and frequency, but also electric fields. However, the biological effects of mechanical strain or electrical field on bone cells are poorly understood. In the present in vitro study, osteoblasts were submitted to only one kind of physical stimulus or a combination of stimuli, and the responses were compared. In the perspective of improving the qualities of bone substitute, we analysed parameters essential for a successfull osteointegration : the extracellular matrice (ECM) as host-biomaterial interface, and angiogenic factors which induce implant vascularization. We investigated the effects of complex mechanical strains based on signals of "low magnitude / high frequency" (LMHF) applied to 3D cultures (macroporous hydroxyapatite). Our study shows that an appropriate combined strain regimen (3 Hz+25Hz) has the potential to functionalise cellularized bone-like constructs. ECM synthesis was promoted by LMHF and the osteogenic properties of this ECM were enhanced while VEGF was not affected. Another system was developed to apply an electric field to cell cultures. Some parameters indicated that cells are sensitive to electric fields ; however VEGF expression was not affected. In contrast, when the physical stimulations were combined (LMHF strain + electric field) gene expression of factors implicated in angiogenesis (VEGF, TGFß1, FGF2...) was increased. The complex stimuli whose effects were analysed in this work could be used as a tool for the functionalization of a cellularized bone substitutesST ETIENNE-Bib. électronique (422189901) / SudocSudocFranceF

Les contraintes mécaniques régulent l'épissage alternatif du VEGF-A dans les ostéoblastes par modulation des activités RhoGTPases

Le Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A : facteur proangiogénique) est indispensable au gain osseux sous contrainte mécanique et est un des facteurs clé de l ostéointégration des biomatériaux. Etant donné que les phases d accélération dans les signaux mécaniques sont critiques pour la réponse cellulaire, nous avons comparé l efficacité de régimes mécaniques variant en fréquences (de 0.05 à 5 Hz) avec un nombre de cycles constant, sur la production du VEGF. Nous avons montré sur plusieurs souches d ostéoblastes (ROS 17.2.8, MG63 et primaires humaines) que nos régimes hautes fréquences (mode pulsé) induisaient spécifiquement la production des isoformes matricielles du vegf (206, 189, 145) et que nos régimes basses fréquences (mode relaxé) induisaient spécifiquement la production des isoformes solubles du vegf (121) avec un maximum d expression 12h-post contrainte. Le VEGF165 est produit sous tous nos régimes, mais sous forme soluble en mode relaxé et matricielle en mode pulsé. L épissage alternatif du VEGFA est donc modulé par l environnement mécanique de l ostéoblaste. La signalisation du VEGF et celle des contraintes mécaniques régulent en commun la polymérisation de l actine contrôlée par les rho-gtpases. La quantification, par G-LISA, des activités de RhoA et RhoABC sous contrainte, nous ont permis de montrer que RhoA est nécessaire mais pas suffisant pour la production de vegf matriciel et que si l activité de RhoA était éteinte, du vegf soluble restait produit en mode relaxé. Le maintien à très long terme de l activité de RhoA nous laisse à penser que le VEGF matriciel (VEGFm) a une signalisation différente de celle du soluble par une possible stabilisation du complexe VEGF/KDR/aVb3. La dernière partie de ce travail a consisté à montrer le rôle biologique de nos matrices fonctionnalisées. L incorporation de VEGFm dans les matrices est maximale après trois épisodes journaliers de contrainte en mode pulsé et celle de deux puissants facteurs anti-angiogénique produits par les ostéoblastes (TIMP-2 et PEDF) est fortement réduite. Le VEGFm possède un rôle promigratoire pour les cellules endothéliales et anti-apoptotique pour les ostéoblastes. L ensemble de ces données encourage l utilisation de sollicitations mécaniques sur des biomatériaux cellularisés par des ostéoblastes permettant une meilleure ostéointégration. Les perspectives directes de ce travail sont de montrer que le VEGF et d autres facteurs d intérêt biologique (FGF2, BMP, PDGF ) peuvent être immobilisés sur des biomatériaux 3D cellularisés avec des ostéoblastes ou des cellules souches et soumis à des contraintes pulsées afin de vérifier leur capacité angiogénique in vivo.ST ETIENNE-BU Médecine (422182102) / SudocSudocFranceF