Oriented antibody immobilization to polystyrene macrocarriers for immunoassay modified with hydrazide derivatives of poly(meth)acrylic acid

BACKGROUND: Hydrophobic polystyrene is the most common material for solid phase immunoassay. Proteins are immobilized on polystyrene by passive adsorption, which often causes considerable denaturation. Biological macromolecules were found to better retain their functional activity when immobilized on hydrophilic materials. Polyacrylamide is a common material for solid-phase carriers of biological macromolecules, including immunoreagents used in affinity chromatography. New macroformats for immunoassay modified with activated polyacrylamide derivatives seem to be promising. RESULTS: New polymeric matrices for immunoassay in the form of 0.63-cm balls which contain hydrazide functional groups on hydrophilic polymer spacer arms at their surface shell are synthesized by modification of aldehyde-containing polystyrene balls with hydrazide derivatives of poly(meth)acrylic acid. The beads contain up to 0.31 μmol/cm(2) active hydrazide groups accessible for covalent reaction with periodate-oxidized antibodies. The matrices obtained allow carrying out the oriented antibody immobilization, which increases the functional activity of immunosorbents. CONCLUSIONS: An efficient site-directed antibody immobilization on a macrosupport is realized. The polymer hydrophilic spacer arms are the most convenient and effective tools for oriented antibody coupling with molded materials. The suggested scheme can be used for the modification of any other solid supports containing electrophilic groups reacting with hydrazides

Reactive trityl derivatives: stabilised carbocation mass-tags for life sciences applications

The rational design of novel triarylmethyl (trityl)-based mass tags (MT) for mass-spectrometric (MS) applications is described. We propose a "pKR+ rule" to correlate the stability of trityl carbocations with their MS performance: trityls with higher pKR+ values ionise and desorb better. Trityl blocks were synthesised that have high pKR+ values and are stable in conditions of MS analysis; these MTs can be ionised by matrix as well as irradiation with a 337 nm nitrogen laser. 13C-Labelled tags were prepared for MS quantitation applications. Moreover, the tags were equipped with a variety of functional groups allowing conjugation with different functionalities within (bio)molecules to enhance the MS characteristics of the latter. The MS behaviour of model polycationic trityl compounds with and without the matrix was studied to reveal that poly-trityl clusters are always singly charged under the (MA)LDI-TOF conditions. Several peptide-trityl conjugates were prepared and comparisons revealed a beneficial effect of trityl tags on the conjugate detection in MS. Trityl compounds containing para-methoxy- and dimethylamine groups, as well as a xanthene fragment, showed considerable enhancement in MS detection of model peptides; thus they are promising tools for proteomic applications. Dimethoxytrityl derivatives allow one to distinguish between Arg- and Lys-containing peptides. Maleimido trityl derivatives are suitable for the efficient derivatisation of thiol-containing peptides in pyridine

СИНТЕЗ ГИДРОФИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 11,11-D2-ЛИНОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ

Previously it was shown that 11,11-D2-linoleic acid effectively quenches the processes of lipid peroxidation in vitro and in cell cultures due to the presence of reinforced C-D bonds in bis-allylic positions, which are most vulnerable to the radicals. Therefore, this compound serves as a promising candidate to treat mitochondrial and eye diseases. The present work deals with the synthesis of the hydrophilic derivatives of 11,11-D2-linoleic acid as prodrug forms with increased solubility in water and biological media and improved pharmacological properties. As modifying reagents, we chose biologically compatible natural compounds, mainly aminoacids, which were attached to 11,11-D2-linoleic acid via amide or ester bond. Among the synthesized compounds there are cationic, anionic and neutral derivatives, and their permeability in eyes will be further tested. Ранее показано, что 11,11-D2-линолевая кислота эффективно подавляет процессы липидного окисления in vitro и в клеточных культурах за счет наличия в ее структуре «усиленных» С-D-связей в бис-аллильных положениях, наиболее чувствительных к действию радикалов. Как следствие, это соединение является перспективным кандидатом в терапии митохондриальных и глазных заболеваний. В данной работе решается задача синтеза гидрофильных производных 11,11-D2-линолевой кислоты, которые могут служить ее пролекарственными формами с увеличенной растворимостью в воде и биологических средах и улучшенными фармакологическими параметрами. В качестве модифицирующих реагентов мы выбрали биологически совместимые природные соединения, преимущественно аминокислоты, присоединяемые к 11,11-D2-линолевой кислоте амидной или сложноэфирной связью. Среди полученных соединений присутствуют катионные, анионные и незаряженные производные, которые в дальнейшем планируется испытать на их способность проникать к сетчатке глаза.

Производные поли(этиленгликоля) в синтезе водорастворимого цианинового красителя Су5

An effective method for the preparation of water-soluble cyanine dye Cy5 using the soluble polymers supported liquid-phase organic synthesis (LPOS) was proposed. Poly (ethylene glycol) methyl ether with a molecular weight of 2000 was used as a polymer substrate, which allowed us to simplify the characterization of products at intermediate stages of synthesis by NMR spectroscopy. This approach makes it easy to obtain the necessary cyanine dyes, which are widely used as fluorescent labels and are popular modifying reagents in biochemistry and medicine.Предложен эффективный метод получения водорастворимого цианинового красителя Су5 при помощи жидкофазного синтеза на водорастворимых полимерных носителях (ЖСВП). В качестве полимерной подложки использовали метиловый эфир поли(этиленгликоля) с молекулярной массой 2000, что позволило упростить процесс характеризации продуктов на промежуточных стадиях синтеза ЯМР-спектроскопией. Данный подход позволяет легко получить необходимые цианиновые красители, которые широко используются в качестве флуоресцентных меток и являются востребованными модифицирующими реагентами в биохимии и медицине

КОНТРОЛИРУЕМОЕ ПЕГИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ АЗИДНЫМИ РЕАГЕНТАМИ-РАЗВЕТВИТЕЛЯМИ С ПОМОЩЬЮ КЛИК-ХИМИИ

Polyethyleneglycol (PEG) is nontoxic, nonimmunogenic, hydrophilic, chargeless and nonbiodegradable poliymer. Its usage as a part of therapeutics protein drugs is common in medicine practice. It is known that covalent attachment of PEG conduces to prolong blood circulation half-lives, improves drug solubility and stability and reduces immunogenicity. It allows optimizing pharmacodynamic and pharmacokinetic drug properties. The goal of structure optimization of therapeutic proteins conjugates with PEG is to reduce loss of biological activity. It can be reached through controlled site- specific pegylation. We introduce two-step modification of proteins with branched polyethylenglycols via click-chemistry, synthesis of branched PEG azide reagent on the base of tris(hydroxymethyl)aminomethane with three linear PEG polymers. At first, we introduce alkyne groups with NHS-ester of alkyne acid in BSA protein. Then, branched PEG azide reagent reacts with alkyne function via CuAAC. Purification of the conjugates was done via gel-chromotography. Number of modifications was calculated from MALDI mass-spectra.Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является нетоксичным, неиммуногенным, гидрофильным, незаряженным и бионеразлагаемым полимером, и его использование в составе терапевтических белковых препаратов вошло в медицинскую практику. Известно, что ПЭГ, соединенный с терапевтическим белком, способствует более длительному нахождению препарата в организме, снижает его иммуногенность и антигенность, повышает растворимость и стабильность в биологических средах, что позволяет оптимизировать фармакокинетические свойства препарата. Одной из целей оптимизации структуры конъюгатов терапевтических белков с ПЭГом является максимальное сохранение биологической активности белка, что может быть достигнуто с помощью контролируемого пегилирования по заданным сайтам белковой молекулы. В настоящей работе представлен метод двухстадийной модификации белков разветвленными полиэтиленгликолями с использованием реакции [3+2] диполярного циклоприсоединения азидов к алкинам. Описан синтез азидного реагента-разветвителя на основе трис(гидроксиметил)аминометана, содержащего три остатка полиэтиленгликоля. Разработана методика двухстадийной модификации модельного белка бычь- его сывороточного альбумина, включающая введение на первой стадии алкиновых групп при помощи N-гидро- ксисукцинимидного эфира алкинокислоты, которые затем вступают в «клик»-реакцию с азидным пегилирующим реагентом-разветвителем. Полученные конъюгаты выделены с помощью гельпроникающей хроматографии. Число введенных модификаций определено при помощи МАЛДИ масс-спектрометрии

Иммуноферментный анализ метаболитов витамина D3

We report herein improved version of the synthesis of hapten based on cholecalciferol and its active metabolite 25-hydroxycholecalcalferol. The methodology of obtaining high-molecular immunogenic conjugates of vitamin D3 derivatives with bovine serum albumin and horseradish peroxidase conjugates for direct ELISA was optimized. Immunisation of rabbits was carried out and polyclonal antibodies to 25-hydroxycholecalceferol were obtained and tested in an enzyme-linked immunosorbent assay. To improve the accuracy of the method, the sample preparation procedure was optimized, including the release of vitamin D3 and its active metabolites from complexes with vitamin D-binding protein.Описан улучшенный вариант синтеза гаптена на основе холекальциферола и его активного метаболита 25-гидроксихолекальцеферола. Оптимизирована методика получения высокомолекулярных иммуногенных конъюгатов производных витамина D3 с бычьим сывороточным альбумином, а также конъюгатов с пероксидазой хрена для прямого ИФА. Проведена иммунизация кроликов, выделены поликлональные антитела к 25-гидроксихолекальцеферолу, которые испытаны в иммуноферментном анализе. Для повышения точности метода оптимизирован процесс пробоподготовки, включающий высвобождение витамина D3 и его активных метаболитов из комплексов с витамин D-связывающим белком

Highly Sensitive Immunochromatographic Identification of Tetracycline Antibiotics in Milk

A rapid immunochromatographic assay was developed for the control of tetracycline (TC). The assay is based on the competition between immobilized TC-protein conjugate and TC in a tested sample for binding with polyclonal anti-TC antibodies conjugated to colloidal gold during the flow of the sample along a membrane strip with immobilized reactants. Conjugation of colloidal gold and the total immunoglobulin (IgG) fraction of polyclonal antibodies was used to increase the assay sensitivity to ensure low content of specific antibodies in the conjugate. This allowed effective inhibition of free TC and conjugate binding in the strip test zone. Photometric marker registration allows control of the reduction of binding, thereby enhancing detection sensitivity. The proposed assay allows TC to be detected at concentrations up to 20 ng/mL, exceeding the limit of detection of the known analogues, in a wide working range (more than two orders) of 60 pg/mL to 10 ng/mL, ensured through the use of polyclonal antibodies. The assay time is 10 min. The efficiency of the designed assay is shown to identify TC in milk; the degree of recovery of TC ranges from 90 to 112%. The precision of the concentrations measurements was no more than 10%

ПОЛУЧЕНИЕ БЕЛКОВЫХ КОНЪЮГАТОВ И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ТЕТРАЦИКЛИНА

We report herein on the methods to introduce a desirable number of modifications into bovine serum albumin and horseradish peroxidase in a controlled manner. The low modification to protein ratio is required when the biological activity of the enzyme has to be preserved, and the high modification to protein ratio is needed when producing immunogens. By varying the linker and the site of antigen binding with the carrier protein, we were able to produce the antibodies of high specificity. Protein conjugates of tetracycline were synthesized and characterized. Immunization of mice was carried out and monoclonal antibodies for immunoassay of tetracycline were obtained and tested in ELISA, IC50=5 ug/ml. Разработаны методы контролируемой химической модификации бычьего сывороточного альбумина и пероксидазы хрена, позволяющие вводить в белок как минимальное число модификаций для сохранения биологической активности в иммуноанализе, так и максимальное – для получения иммуногенов, а также варьировать линкер и сайт связывания антигена с белком для повышения специфичности иммунного ответа. Получены и охарактеризованы белковые конъюгаты тетрациклина. Проведена иммунизация мышей, выделены моноклональные антитела к тетрациклину, которые испытаны в иммуноферментном анализе тетрациклина. Чувствительность определения составила IC50=5 мкг/мл.

Конъюгация наночастиц магнетита с олигонуклеотидами для магнитной доставки онколитической РНК

The synthesis of magnetic nanoparticles conjugated with oligonucleotides has been described. The conjugates prepared were used for immobilization of the model oligonucleotide sequence imitating the oncolytic RNA strand fragment.Описано получение конъюгатов олигонуклеотидов с наночастицами магнетита. Синтезированные конъюга-ты использовали для иммобилизации модельной последовательности, соответствующей фрагменту онколитической РНК

СИНТЕЗ КОНЪЮГАТОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ПРОИЗВОДНЫМИ 11,11-D2-ЛИНОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ ПО РЕАКЦИИ АЗИД-АЛКИНОВОГО ЦИКЛОПРИСОЕДИНЕНИЯ

A new approach to the synthesis of oligonucleotide-fatty acid conjugates is reported. It is based on Cu-catalyzed reaction between azide oligonucleotides and fatty acid derivatives with terminal triple bond (CuAAC). To demonstrate this approach, five derivatives of 11,11-D2-linoleic acid containing terminal alkyne group at different parts of the molecule were synthesized. A method of conjugation of alkyne 11,11-D2-linoleic acid with azide oligonucleotide T20 is developed, and the conditions (time, concentration of Cu catalyst, excess of alkyne reagent, composition of the solvent, etc.) are optimized. These conjugates are stable in biological media, have increased permeability through the cell membranes and can be used in gene therapy. Предложен новый подход к синтезу конъюгатов олигонуклеотидов и жирных кислот, основанный на медь-катализируемой реакции циклоприсоединения азидсодержащих олигонуклеотидов к производным жирных кислот с терминальной тройной связью (CuAAC). Для демонстрации этого подхода осуществлен синтез пяти производных 11,11-D2-линолевой кислоты, содержащих концевую тройную связь в различных частях молекулы. Разработана методика их конъюгации с азидсодержащим модельным олигонуклеотидом Т20, проверено влияние различных условий (времени, концентрации катализатора, избытка алкинсодержащего реагента, состава растворителя и др.) на выход продукта. Такие конъюгаты устойчивы в биологических средах, обладают повышенной способностью проникать в клетки и могут найти применение в качестве средств генной терапии.