Transplantacija spermatogonija kao nova metoda u akvakulturi i konzervaciji riba

Poslednjih godina, primena primordijalnih germinativnih ćelija (primordial germ cells - PGCs) i spermatogonijalnih stem ćelija (spermatogonial stem cells - SSCs) riba je postala veoma značajna zbog razvoja metode transplantacije ovih ćelija. Od kada su Brinster i Avarbock (1994) razvili ovu metodu, ona se uspešno koristi za čuvanje genetskog materijala ugroženih vrsta i u stvaranju novih transgenih linija kod miševa i domaćih životinja. Uvođenje ove metode kod riba predstavlja značajan napredak u oblasti reproduktivne biotehnologije, akvakulture, konzervacione biologije, kao i u razvoju novih transgenih linija različitih vrsta riba. Osnovu ove metode predstavlja transplantacija germinativnih ćelija (PGC, SSC) iz donorskog organizma u organizam primaoca. Najinteresantnija u tom smislu je upotreba nediferenciranih spermatogonija A tipa (Aund) koje imaju sposobnost samoobnavljanja ali i proizvodnje ćelija kasnijih faza spermatogeneze. Postoji takođe nekoliko specifičnih osobina SSC koje ih čine pogodnim za transplantaciju: (1) sposobnost da kolonizuju testis primaoca odakle produkuju donorsku spermu, (2) mogućnost da se nakon transplantacije u primaocu muškog pola razviju u spermatogonije, a u primaocu ženskog pola u oogonije i (3) mogućnost genske manipulacije sa ciljem produkcije transgenih riba (Lacerda i sar., 2010). Prilikom transplantacije SSC, posebna pažnja mora biti usmerena ka izboru vrste donora i primaoca. Najbolje bi bilo da donor i primalac ne budu filogenetski previše udaljeni, kao i da primalac ima kratak reproduktivni ciklus i manje dimenzije tela kako bi ekonomski bio pogodniji za gajenje. Donorska vrsta je obično vrsta za koju postoji određneni interes, bilo ekonomski, naučni ili konzervacioni. Tokom transplantacije, kompatibilnost između primaoca i donora može biti ograničavajući faktor u uspehu samog procesa. U najgorem slučaju, primalac, usled imune reakcije, može u potpunosti odbaciti transplantirano tkivo ili ćelije. To je najčešće slučaj ukoliko se vrši transplantacija SSC iz odraslog donora u odraslog primaoca. Kako bi se izbegao problem izazvan transplantacijom između dve odrasle jedinke, koristi se prednost ontogenije primaoca, posebno ontogenije njegovog imunog sistema, tako što se za primaoca koriste embrioni ili larve. Ovi stadijumi kod riba nemaju razvijen imuni sistem niti diferencirane T-ćelije (Takeuchi et al., 2003; Yoshizaki et al., 2011) te s toga nemaju mehanizam pomoću kojeg bi odbacili donorsko tkivo. Takođe, lakše je blokirati razvoj endogenih primordijalnih germinativnih ćelija kod larvi, nego ukloniti SSC iz već razvijenih gonada kod odraslog donora. Pored odabira odgovarajuće vrste donora i primaoca, neophodno je na pravi način izolovati specifične ćelije koje treba da budu transplantirane. Ovaj proces je donekle jednostavniji kada je u pitanju tansplantacija PGC s obzirom na njihov daleko manji broj u odnosu na spermatogonije i na to da one još uvek nisu potpuno razvijene u gonadama. S druge strane, SSC su dobro razvijene u gonadama i najčešće zauzimaju karakteristično mesto unutar pojedinačnih niša u testisu specifičnih za tu vrstu ćelija. Prilikom izolacije nediferenciranih spermatogonija A tipa iz testisa odrasle jedinke, veome je bitno voditi računa od morfologiji tih ćelija kao i specifičnim markerima pomoću kojih ih je moguće razlikovati od ostalih tipova spermatogonija (Adiff, B), spermatocita i spermatida. Osnovne histološke metode u kombinaciji sa imunohistohemijom, in situ hibridizacijom ili in situ PCR metodom se mogu koristiti za identifikaciju spefifičnih molekularnih markera (proteina ili RNK) u ćelijama unutar ćelijskih niša i koji se u daljem toku rada mogu koristiti za izolaciju određenih ćelija. Pre transplantacije PGC ili SSC, neophodno je izolovati željene ćelije iz donorskog tkiva. Nakon multienzimske razgradnje tkiva testisa, ćelije se izoluju na osnovu njihove morfologije i veličine i/ili specifičnih molekularnih markera zbog kojih čitav proces može biti species-specifičan. Kombinacija transplantacije PGS i SSC sa krioprezervacijom daje dodatni značaj ovoj metodi s obzirom da još uvek ne postoji optimizovan protokol za uspešnu krioprezervaciju jaja i embriona riba, pre svega zbog prisustva velike količine žumanceta i masti. Krioprezervacija ćelija kao što su PGS i SSC, koje imaju mogućnost da produkuju spermatozoide ili oocite u zavisnosti od pola jedinke primaoca, ima izuzetno veliku perspektivu primene u konzervacionoj biologiji i akvakulturi. Istraživanja su pokazala da krioprezervirane SSC nakon odmrzavanja i transplantacije u telo primaoca mogu proizvesti spermatozoide i oocite donorske vrste (Kobayashi et al., 2007). Na taj način, čuvanje gameta nije neophodno jer krioprezervacijom germinativnih ćelija i njihovom transplantacijom, moguće je dobiti gamete oba pola.In recent years, the importance of manipulations of primordial germ cells (PGCs) and spermatogonial stem cells (SSCs) in fish has drastically increased due to development of transplantation method of these cells. Since its development by Brinster and Avarbock (1994), this method has been successfully used in the preservation of genetic material of endangered species and in the creation of new transgenic lines of mice and farm animals. Introduction of this method in fish leads to advances in reproductive biotechnology, aquaculture, development of new transgenic lines and conservation biology of fish. The base of this method lies in the transplantation of the germinative cells (PGCs, SSCs) from donor organism into recipient organism. Undifferentiated spermatogonia type A (Aund) which have the ability of self-renewal are the most interesting for transplantation since they have the ability of self-renewal, but can also produce later stage cells. There are several advantages of using SSCs in transplantation process: (1) the capability of SSCs to colonize the testis of the recipients where they are able to produce donor-derived sperm, (2) plasticity in development since SSCs can develop into spermatogonia in male recipients and oogonia in female recipients and (3) the possibility of genetic manipulation in SSCs in order to produce transgenic fish (Lacerda et al., 2010). When transplanting SSCs, special attention must be given to the choice of donors and recipients species. It is best that donor and recipient organisms are phylogenetically not too distant, that recipient organisms have a short reproductive cycle and that they are small for a more economic rearing. Donor species are usually species which attract certain interest, whether its an economic, scientific or conservation interest. During transplantation, compatibility between recipient and donor may be a very limiting factor in transplantation success. In the worst-case scenario, recipients may completely reject the transplanted tissue or cells due to immunological reaction. This is especially the case when transplanting SSCs isolated from adult donors into adult recipients. In order to evade the problems caused by adult-adult transplantations, scientists have taken advantage of the ontogeny of recipients, mainly the ontogeny of their immune system, and used embryos and larvae as recipients. Embryos and larvae do not have a developed immune system nor differentiated T-cells (Takeuchi et al., 2003; Yoshizaki et al., 2011), therefore they do not have mechanisms to reject the donor tissue. Furthermore, it is easier to knock-out larval endogenous PGCs than to deplete SSCs from already developed gonad. Apart from choosing the right donor and recipient organisms, it is necessary to isolate specific cells that need to be transplanted. This is to some extent easier when transplanting PGCs, since there are fewer of them than SSCs, and they have not yet fully developed inside the gonads. On the other hand, SSCs are well developed inside the gonads and usually take their specific place within the spermatogonial stem niche. When isolating undifferentiated spermatogonia type A from adult testis, special attention must be given to their morphology and specific markers that distinguish them from other types of spermatogonia (Adiff, B), spermatocytes and spermatids. Basic histology may be coupled with immunohistochemistry, in situ hybridization or in situ PCR which would enable the identification of specific molecular markers within the cells of the niche (proteins or RNA). All this data can be further used in isolation of particular cells. Prior to transplantation, PGCs and spermatogonia need to be isolated from the donor tissue. After multi-enzymatic digestion it is possible to isolate cells based on their morphology and size, and/or specific molecular markers and the whole process can be species-specific. A great advantage of transplantation of PGCs and SSCs is that this method can be very well combined with cryopreservation. There are still no optimized protocols for cryopreservation of fish eggs and embryos, mostly due to presence of large amount of yolk and fat. Since PGCs and SSCs can develop into both sperm and eggs, cryopreservation of these cells could have a great perspective in conservation biology but also in aquaculture. Studies have shown that frozen/thawed SSCs transplanted into recipients give rise to potent donor sperm and eggs in the recipients (Kobayashi et al., 2007). In this way, there is no need to conserve both sperm and eggs since successful cryopreservation of germ cells can give rise to both sperm and eggs after transplantation

Indeks efikasnosti mresta kao alatka za istraživanje i proizvodnju u akvakulturi

Intenzivno gajenje u akvakulturi je vrsta proizvodnje koja zahteva strogu kontrolu celog proizvodnog procesa. Ovo takođe važi za protokol reprodukcije, koji predstavlja prvi korak u intenzivnoj akvakulturi. Efikasan protokol za reprodukciju je obično zasnovan na jednom broju veoma detaljnih eksperimenata, gde se svi faktori odgovorni za efikasnost mresta proveravaju. Međutim, glavna slaba tačka ovog procesa je ta što su zaključci o efikasnosti pojedinačnih protokola zasnovani na kratkoročnim ekperimentima, čiji su glavni indikatori preživljavanje embriona, stopa izleganja ili uopšteni kvalitativni parametri ranih stupnjeva larvi. Cilj ove studije je da proveri da li specijalno dizajniran indeks efikasnosti mresta (koji predstavlja broj mlađi proizveden u odnosu na jedinicu težine ženki) može da pokaže značajne razlike i slabosti najčešće korišćenih markera za kvalitet jaja, koji su indikatori efikasnosti mresta. Izabrana vrsta za model bio je Evroazijski grgeč, koji je danas jedan od najboljih kandidata za gajenje u intenzivnom sistemu u slatkim vodama. Ribe su, u toku jeseni uzete iz zemljanog ribnjaka. Riba je bila izložena hladnim vremenskim uslovima u periodu od 40 dana. Ženke su zatim, kada je temperatura vode ponovo dostigla 10°C, nasumično raspodeljene u 6 tretmana (n=10 za svaku grupu). Svaka grupa bila je podvrgnuta različitim protokolima stimulacije hormona sa lososovim GnRHa (10, 25, 50 i 100 µg kg-1 u toku prvog ubrizgavanja i sa100 µg kg-1 u toku drugog, sedam dana posle prve aplikacije). Nakon toga, ribe su stavljene u odvojene tankove od 300 l. Posle drugog ubrizgavanja, temperatura je podignuta na 12°C a svakom tanku dodato je 10 muških jedinki (koje su 4 dana ranije primile injekciju hCG u dozi od 500 IU kg-1). Riba je ostavljena da se spontano mresti. Jaja su sakupljana u narednih 10 dana i inkubirana na 14°C. Stopa preživljavanja embriona ustanovljena je u stadijumu očnog mehura. Posle izvaljivanja larve grgeča su gajene (iz svake grupe odvojeno) prateći isti protokol u toku od 48 dana. Larve su prvo hranjene sveže izvaljenim Artemia nauplii. 28og dana, gajene larve su nasilno odviknute i prebačene (bez uporedog hranjenja) na komercijalnu hranu. Ustanovljena je stopa preživljavanja mlađi iz svake grupe posle odvikavanja i ukupna dužina tela (TL, mm). Izračunat je i indeks efikasnosti mresta (SEI) za svaku grupu, i on predstavlja broj odviknutih riba dobijenih od 1 kg ženki. U kontrolnoj grupi 1 (koja je dva puta tretirana placebom) ovulacija se nije desila. U kontrolnoj grupi 2, dve ribe su ovulirale. Primena procesa u nekoliko ponavljanja izazvala je ovulaciju u 40 i 60%. Stopa preživljavanja embriona kod sakupljenih jaja bila je najniža u kontrolnoj grupi II. Među ostalim grupama zabeležena je slična stopa preživljavanja embriona. Nije bilo razlika među izlegnutim larvama, ako se uzme u obzir efikasnost punjenjaribljeg mehura kao i krajnja TL proizvedene ribe. Najniže SEI vrednosti zabeležene su u kontrolnoj grupi II. Najviše SEI vrednosti zabeležene su kod ribe koja je inicijalno tretirana sa 10 i 25 µg kg-1. Rezultati ove studije pokazuju da je SEI vrednost jako dobar i siguran indicator koji dozvoljava pouzdanu verifikaciju reproduktivnih protokola. Međutim, čini se da broj proizvedenih larvi sa napunjenim mehurom takođe može da posluži kao dobar indikator kvaliteta mresta. Ovakav indikator bi načinio process verifikacije efikasnosti reproduktivnih protokola mnogo kraćim i manje napornim, nego što se to ranije mislilo. Takođe, rezultati ove studije pokazuju da ponavljana primena GnRHa može da poboljša mrest izvan sezone. Međutim, potrebno je raditi na optimizaciji doza i intervalima u kojima se daju injekcije da bi se proverila korisnost ovog procesa

Veštaško razmnožavanje i reproduktivne osobine čikova (Misgurnus Fossilis)

U našem istraživanju je dvanaest ženki i osam mužjaka čikova veštački reprodukovano pre sezone mresta. Riba je uneta u laboratorijske tankove u rano proleće i ženke su tretirane sa 10 mg/kg telesne težine sa CP (ekstrakt hipofize šarana), dok su mužjaci hipofizirani sa 5mg/kg telesne težine radi izazivanja ovulacije i spermijacije. Ženke su ovulirale u narednih 18 do 24 časa i posle istiskivanja jaja su bila oplođena. Vrednosti pseudogonadosomatskog indeksa PGSIkod 4 ženke veoma su varirale (3.6 – 22.2%), stopa oplođenja je varirala od 30.34 do 93.81 % posle 24 časa od oplođenja. Tri dana po oplođenju larve su se izvalile (14.84-91.8%) i započele sa prvom egzogenom hranom šestog dana. Čikov se može razmnožavati kao i šaranske vrste u mrestilištima, jedina poteškoća je mala količina gameta. Veštačko razmnožavanje i uzgoj larvi može da pomogne u značajnom jačanju populacija, tako da bi bila moguća repopulacija već redukovanih populacijaii stvaranje novih staništakoji odgovaraju ovoj vrsti. Vijabilne larve iz interspecijske hibridizacije su se izlegle i na osnovu njihove morfologije mlađ nije ličila na hibride, što bi moglo da ukaže na sposobnost aseksualnog razmnožavanja. Genetička analiza nije pokazala genom mužjaka kod mlađi. F1R1 potomci su bili 50% tetraploidi (4n=100)i 50 % heksaploidi (6n=150). Ovo je prvi rezultat stvaranja heksaploida (broj hromozoma 150) čikova u laboratorijskim uslovima

Vitrifikacija mleča grgeča (perca fluviatilis)

Vitrifikacija je proces dovođenja vode ili rastvora u čvrsto stanje, odnosno u amorfno ili staklasto stanje koje može da se dostigne veoma brzom hlađenjem (106-1010 °C/s). Nedavno je objavljeno nekoliko istraživanja o vitrifikaciji mleča različitih vrsta riba, međutim nema dostupnih informacija o vitrifikaciji mleča grgeča (Perca fluviatilis). Mužjaci grgeča su uzorkovani 6 dana posle hormonske injekcije (250 IU kg-1 hCG). Evaluirana je pokretljivost spermatozoida pomoću sistema kompjuterske analize sperme CASA. Za process vitrifikacije mleč je razblažen modifikovanim Tanaka ekstenderom na finalni odnos 1:5 (sa krioprotektantima). Posle preliminarnih testova sa kombinacijom metanola i propilen glikola (PG) u različitim koncentracijama, odlučeno je da se koristi 15% metanola i 15 % PG (ukupno 30% krioprotektanata). Suspenzija mleča je ubačena direktno u tečni azot bez prethodnog hlađenja u njegovoj pari. Za sve eksperimente vitrifikacije za hlađenje su korišćene cevčice Cryotop (Kitazato-Dibimed, za 2 µl rastvora). Za fertilizacioni test su prikupljena jaja ženki grgeča. Vitrifikovane Cryotop cevčice otopljene su direktno u 10 µl rastvora za aktivaciju (50 mm NaCl) u petri šoljama koje su sadržale jaja. Svež mleč služio je za kontrolu. Oplođena jaja su inkubirana u plivajućem sistemu. Izvedena su 3 ogleda da bi se utvrdio odgovarajući broj cevčica Cryotop za svaku seriju jaja: 1, 6 i 18 cevčica Cryotop je isprobano za svaku seriju jajnih ćelija. U 2 µl rastvora mleča jedne Cryotop cevčice bilo je oko 0,33 µl mleča. Na osnovu stepena oplođenja u tri ogleda može se zaključiti da povećanje broja Cryotop cevčica pojačava stepen oplođenja. Dalja sitraživanja su neophodna da bi se razvio metod vitrifikacije sa većim preživljavanjem larvi posle oplođenja vitrifikovanim mlečom. Takođe je potrebno ispitati stepen izvaljenih embriona iz ogleda sa vitrifikovanim mlečom, kao i potencijalni uticaj vitrifikacije na larve, pre svega na deformitete i morfološke promene

Poreklo i genetička struktura nekoliko mađarskih divljih i domestifikovanih populacija potočne pastrmke na osnovu PCR-RFLP i mikrosatelitskih markera

U Evropi je, na osnovu studija mitohondrijalne DNK, identifikovano pet evolutivnih linija potočne pastrmke (Salmo trutta m. fario L. 1758): Atlanska, Dunavska, Mediteranska, Jadranska i Mramorna. Mađarske linije bi teorijski trebalo da pripadaju Dunavskoj liniji na osnovu hidrogeografije zemlje, ipak, ovo nije potvrđeno genetičkim studijama. Korišćeni su molekularni markeri da bi se ispitalo genetička pozadina populacije potočne pastrmke u Mađarskoj. Istraživanja su uključila jedini matični nasad potočne pastrmke u Mađarskoj, kao i po jedna populacije u planinskim vencima Bükk, Aggtelek, Börzsöny i Visegrádi, po jedna populacija u svakom. Genetička analiza je do sada sprovedena na 533 individue, isečak peraja je uzorkovan sa svake ribe i PCR-RFLP (kontrolni region mitohondrijalne DNK, laktat dehidrogenaza i somatolaktin geni), kao i analiza mikrosatelitnih markeri (BFRO002, OMM1064, Ssa408uos, SsoSL417, SsoSL438) su bili korišćeni da bi se razlikovale Dunavska i Atlanska linija potočne pastrmke. Na osnovu genetičke analize mitohondrijalne DNK divljih populacija, udeo Dunavskog haplotipa je nizak (< 10 %), sa izuzetkom potoka Apátkúti u planinama Visegrádi, gde je nađena relativno visok udeo Dunavskog haplotipa (34%). 401 analizirani primerak matičnog jata farme je skoro u potpunosti Atlanski haplotip, što ukazuje na efekat osnivača. Iako su kasnije prikupljeni primerci iz obližnjeg potoka i pridodati matičnom jatu, njihov broj je bio ograničen jer su uglavnom svi bili mužjaci. Budući da je jedino matično jato u Mađarskoj, ribe sa ove farme se koriste za poribljavanje od strane ribolovaca, što može dovesti do značajnog uticaja na prirodne populacije. Na osnovu analize nuklearnih markera sve populacije su veoma heterogene. Veliki udeo (60-80%) Atlanskih alela primećen za ove markere na svim lokacijama gde je obavljano uzorkovanje ukazuje na efekat intenzivnog poribljavanja mađarskih salmonidnih regiona. Analize mikrosatelitskih markera su ukazale na visoku heterozigotnost i Hardy-Weinberg-ovu ravnotežu svih populacija

Ponovo uvođenje manića u akvakulturu Mađarske (preliminarni rezultati)

Burbot (Lota Lota) is a native species in Hungary and is known to live in most of our rivers. It is a popular but slightly rare catch among anglers. The length of the larger sized individuals varies between 40 and 50 centimeters, rarely reaches 60 cm, the national record is 3,56 kg from 2001 (Harka and Sallai, 2007). The Hungarian aquaculture industry is interested in rearing this species for a while, however in spite of some foreign research teams having started to work on investigating the rearing of burbot (Żarski et al., 2010; Trabelsi et al., 2011; Lahnsteiner et al., 2012;), this species does not have a developed and detailed reproduction and rearing technology. The previous national studies (e.g. Keresztessy and Rideg, 2001) and the increasing consumer and angler needs made us to begin the rearing and reproduction of burbot again. Two Polish, RAS reared burbot population delivery arrived to Hungary lately: 1000 pcs larvae with 15 g average weight on 08.10.2014 and 100 pcs broodstock with 210 g average weight on 15.12.2014 from the laboratory of the Warmia and Mazury University. The fish were introduced to RAS system here as well, in the fish farm of Zoltán Szabó self-entrepreneur. Larvae were fed with Scretting trout feed (protein: 42%, fat: 14%), at the start in an amount of 140 g/day, later, until 13.04.2015 in an amount of 280 g/day. By this time, the average weight reached 62 g, and altogether 96 individuals died (survival rate: 90,4%) For feeding the broodstock intended for reproduction, the feed was the same Scretting feed, and after one month, we have changed to Aquabio (protein: 54%, fat: 17%). By 13.04.2015 the average weight reached 300 g, survival rate is 50% due to a bacterial infection. The water temperature was constant 14˚C. For the purpose of reproduction, we have placed 40 females into a 700 l tank, where we have reduced the water temperature to 2-2,5 ˚C in a very short time. We could strip eggs from 13 individuals at 3 different dates (20.03, 24.03, and 26.03) and success rates (PGSI: 11,75 % ±11,75; 24,43 % ±4,40; 12,92% ±3,62). In addition to the rearing and reproduction technology experiments, we have conducted a preliminary fish processing experiment as well, where we tested the following parameters: weight of intestines, liver, head, spine, and meat, the characteristics of the fish meat, reactions during kitchen preparation and taste after preparation. The work was supported by the project number 8526-5/2014/TUDPOL of the Ministry of Human Resources of Hungary.Manić (Lota Lota) je nativna vrsta ribe u Mađarskoj i poznato je da on živi skoro u svim našim rekama. Među pecarošima, ova vrsta je veoma popularna mada je retka kada je reč o ulovu. Dužina većih jedinki varira između 40 i 50 santimetara, retko dostiže dužinu od 60 santimetara, a državni rekord od 3,56 kg dostignut je 2001. godine (Harka and Sallai, 2007). Mađarska industrija za akvakulturu je zainteresovana za gajenje ove vrste već neko vreme, međutim uprkos činjenici da su neki strani istraživački timovi počeli da rade na istraživanju metoda za gajenje manića (Żarski et al., 2010; Trabelsi et al., 2011; Lahnsteiner et al., 2012;), ova vrsta nema detaljno razvijenu tehnologiju za reprodukciiju i uzgoj. Prethodna istraživanja na nivou države (e.g. Keresztessy and Rideg, 2001) i povećane potrebe potrošača i pecaroša podstakli su nas da ponovo započnemo uzgoj i reprodukciju manića. Nedavno su u Mađarsku dostavljene 2 populacije manića gajene u Poljskoj u RAS sistemu: 08.10.2014 dostavljeno je 1000 larvi prosečne težine 15g, a 15.12.2014 dostavljeno je 100 matica prosečne težine od 210g iz laboratorija Univerziteta Warmia i Mazury. Ribe su i u Mađarskoj uvedene u RAS sistem, na privatnom ribnjaku Zoltána Szabó. Larve su hranjene sa Scretting hranom za pastrmke (proteina: 42%, masti: 14%), na početku sa 140 g/dnevno, a kasnije i do 13.04.2015 sa 280 g/dnevno. Do tog datuma, prosečna težina jedinki dostigla je 62 g, a ukupno 96 jedinki je uginulo (stopa preživljavanja: 90,4%). Ista hrana, Scretting, korišćena je i za hranjenje matica za reprodukciju, međutim posle mesec dana, promenili smo je i počeli da koristimo Aquabio (proteina: 54%, masti: 17%). Do 13.04.2015 prosečna težina dostigla je 300 g, a stopa preživljavanja bila je 50% zbog bakterijske infekcije. Temperatura vode bila je konstantna: 14˚C. Da bi izvršili reprodukciju, stavili smo 40 ženki u tank od 700 l, u kome smo za jako kratak vremenski period snizili temperaturu na 2-2,5 ˚C. Uspeli smo da istisnemo ikru od 13 jedinki u tri različita dana (20.03, 24.03, i 26.03) sa stopom uspeha od PGSI: 11,75 % ±11,75; 24,43 % ±4,40; 12,92% ±3,62). Osim tehnoloških eksperimenata za gajenje i reprodukciju, izvršili smo preliminarni ekperiment prerade ribe, u kome smo testirali sledeće parametre: težinu creva, jetre, glave, kičme i mesa, karakteristike ribljeg mesa, reakcije u toku pripreme u kuhinji i ukus nakon pripreme. Rad je podržan projektom 8526-5/2014/TUDPOL Ministarstva Ljudskih Resursa Mađarske

Procena kvaliteta i metode krioprezervacije sperme grgeča (perca fluviatilis) uzorkovane van sezone

Eurasian perch (Perca fluviatilis) is a promising species among those that were recently introduced into European aquaculture. Out-of-season spawning is a remarkable factor in artificial propagation of every species. The production of Eurasian perch is mainly (Northern and Western Europe) maintained in recirculating systems where all year long production is a key factor in the satisfaction of current market demands (Migaud et al. 2002). Cryopreservation of sperm could be an efficient tool to reduce the costs of broodstock management and provide good quality gametes all year round (Cabrita et al. 2010). A broodstock of wild caught Eurasian perch (Perca fluviatilis) males was established from October to November 2014. The 13 males (bodyweight: 39-137 g) were kept at the same water temperature in the range of 6-16°C (according to the hatchery temperature). Spermiation was hormonally stimulated using 500 IU-1 kg hCG (human chorionic gonadotropin). Sperm was stripped 1 day and 6 days after injection according to the experimental design. Motility parameters of fresh and thawed sperm without injection (Wo), 1 day (1da) and 6 days (6da) after injection were measured using a CASA system. The total volume was estimated in all treated freshly stripped groups. Perch sperm was cryopreserved without injection, 1 day after and 6 days after injection according to our previously developed cryopreservation protocol. A controlled rate freezer with a cooling program (from 7.5 ºC to -160 ºC, cooling rate: 56 ºC/min) was used (Bernáth et al. 2015). The largest volume of sperm was stripped 6 days after injection (1611 ± 1428µl). Average sperm volume was significantly lower in Wo (58 ± 82µl) compared to 6da. Total volume of sperm at 1da did not differ significantly from the other groups (64 ± 49µl). Progressive motility of freshly stripped perch sperm was similar after hormonal stimulation (Wo: 79 ± 10%, 1da: 54 ± 26%, 6da: 75 ± 11%). The same tendency was observed in the case of curvilinear velocity (VCL) of spermatozoa (Wo: 149 ± 24 μm/s, 1da: 137 ± 23 μm/s, 6da: 145 ± 40 μm/s) and straightness (STR) of sperm movement (Wo: 76 ± 7%, 1da: 80 ± 1%, 6da: 80 ± 8%) in freshly stripped sperm.A similar progressive motility, VCL and STR was measured after thawing among cryopreserved groups. However, progressive motility was significantly reduced after cryopreservation in the group 6da (11 ± 7%) compare to fresh Wo and 6da (see above). Post-thaw motility did not decrease significantly in Wo (18 ± 8%) and 1da (14 ± 5%). A significant reduction was observed after thawing in VCL 6da (70 ± 11 μm/s) compared to all fresh groups. A significantly decreased VCL was recorded in Wo (88 ± 25 μm/s) after cryopreservation compared to fresh Wo and 6da. Post-thaw VCL in 1da (101 ± 15 μm/s) did not change in comparison to freshly stripped groups. STR was quite high after thawing in all cryopreserved groups (Wo: 90 ± 5%, 1da: 92 ± 2%, 6da: 88 ± 4%). A significant difference was observed between thawed 1da and fresh Wo. Hormonal stimulation was succesfully used in the out-of-season induction of spermiation in male Eurasian perch. Eurasian perch sperm can be cryopreserved out-of-season, as well. The work was supported by the projects EUREKA_HU_12-1-2012-0056, 8526-5/2014/TUDPOL of the Ministry of Human Resources of Hungary awarded to Szent István University and the GOP-1.1.1- 11.2012-0306.Od svih vrsta koje su introdukovane u evropsku akvakulturu, grgeč (Perca fluviatilis) najviše obećava. Mogučnost mrešćenja van sezone je jedan od najbitnijih faktora u veštačkom mrestu bilo koje vrste. Gajenje grgeča (u severnoj i zapadnoj Evropi) se uglavnom obavlja u recirkulacionim sistemima, gde je mogućnost proizvodnje u toku cele godine ključni faktor da bi se zadovoljile potrebe tržišta (Migaud et al. 2002). Krioprezervacija sperme je efikasan način smanjenja troškova koji nastaju držanjem matica i pruža dobar kvalitet gameta tokom cele kalendarske godine. (Cabrita et al. 2010). Matice grgeča (Perca fluviatilis) su izlovljavane u periodu od oktobra do novembra 2014. 13 mužjaka (težina: 39-137 g) su čuvani u vodi čija je temperatura iznosila 6-16°C. Ispuštanje sperme je indukovano hormonima, korišćenjem 500 IU-1 kg hCG (humanog horionskog gonadotropina). Sperma je sakupljena 1. i 6. dana nakon ubrizgavanja hormona. Parametri pokretljivosti spermatozoida sveže i odmrznute sperme bez ubrizgavanja hormona (Wo), nakon 1. (1da) i nakon 6. (6da) dana ubrizgavanja hormona su kvantifikovani CASA sistemom. Ukupna zapremina sperme nakon istiskanja je izmerena u svim tretmanima. Sperma grgeča bez i sa injektiranog hormona nakon 1. i 6. dana je prezervirana u skladu sa prethodno definisanim protokolima. Za prezervaciju je korišćen zamrzivač sa automatskim programom hlađenja (od 7.5 ºC do -160 ºC, stopa hlađenja: 56 ºC/min) (Bernáth et al. 2015). Sperma sa najvećom prosečnom zapreminom je istisnuta u 6da grupi riba (1611 ± 1428µl). Prosečna zapremina sperme je bila značajno niža u grupi Wo (58 ± 82µl) u odnosu na grupu 6da. Prosečna zapremina sperme u grupi 1da (64 ± 49µl) se nije statistički razlikovala od druge dve grupe. Progresivna pokretljivost spermatozoida u sveže istisnutoj spermi je bila slična pokretljivosti nakon hormonalne stimulacije (Wo: 79 ± 10%, 1da: 54 ± 26%, 6da: 75 ± 11%). Ista tendencija je zabeležena u slučaju brzine nepravilnog kretanja (VCL) spermatozoida (Wo: 149 ± 24 μm/s, 1da: 137 ± 23 μm/s, 6da: 145 ± 40 μm/s), kao i pravolinijskog kretanja (STR) spermatozoida (Wo: 76 ± 7%, 1da: 80 ± 1%, 6da: 80 ± 8%) u sveže istisnutoj spermi. Slične vrednosti progresivne pokretljivosti, VCL-a i STR-a su izmerene u krioprezerviranim uzorcima nakon odleđivanja sperme. Ipak, progresivna pokretljivost je značajno redukovana u grupi 6da nakon krioprezervacije (11 ± 7%) u poređenju sa sveže istisnutom spermom u grupama Wo i 6da. Pokretljivost u odleđenoj spermi nije značajno opala u grupama Wo (18 ± 8%) i 1da (14 ± 5%), dok je značajno smanjenje primećeno za parametar VCL u grupi 6da, nakon odleđivanja (70 ± 11 μm/s) u odnosu na sve grupe gde je sperma sveže isceđena. Značajno smanjenje u parametru VCL je primećeno u grupi Wo (88 ± 25 μm/s) nakon krioprezervacije u poređenju sa grupama Wo i 6da kada je sperma sveže istisnuta. Parametar VCL u grupi 1da nakon odleđivanja (101 ± 15 μm/s) se nije promenio u odnosu na sveže isceđene grupe. Vrednosti STR-a su bile jako visoke nakon odleđivanja u svim krioprezerviranim grupama (Wo: 90 ± 5%, 1da: 92 ± 2%, 6da: 88 ± 4%). Značajna razlika je primećena između grupe 1da, posle odleđivanja i sveže istisnute sperme grupe Wo. Ovi rezultati su pokazali da je hormonalna stimulacija uspešno sprovedena kod mužjaka grgeča u cilju indukovanja proizvodnje sperme van sezone parenja

Osobine sperme u toku skladištenja nakon krioprezervacije kod linjaka (Tinca Tinca l.): Značaj za akvakulturu

The aim of this study was to test the effects of various cryoprotectants on the motility of tench sperm, and also on the sperm features one hour after thawing. Two experimental groups were formed, each for different cryprotectants. Methanol was used in the first group, and DMSO in the second. Results displayed statisticaly significant differences in sperm motility between groups right after thawing. The test was continued only for the methanol group which showed satisfying progressive motility right after thawing. During the one hour post-thawing storage test, there were no significant differences in the progressive motility which indicated that the combination of methanol (10%) and Grayling extender presnt a favorable combination for cryopreservation and storage of tench sperm.Cilj rada je bio da se ispita uticaj različitih krioprotektanta na pokretljivost spermatozoida linjaka nakon krioprezervacije, kao i na njihove osobine u toku jednog časa nakon odmrzavanja. Formirane su dve eksperimentalne grupe u zavisnosti od krioprotektanta. U prvoj grupi uzorak je pripreman sa metanolom, a u drugoj sa DMSO. Rezultati su pokazali da odmah nakon odmrzavanja postoji statistički značajna razlika u progrisvnom motilitetu testiranih grupa te je test skladištenja mogao biti nastavljen jedino sa uzorkom sa metanolom za koje su dobijene zadovoljavajuće vrednosti. U toku jednog časa skladištenja nije došlo do statistički značajne promene u pokretljivosti. Može se zaključiti da je kombinacija metanola (10%) i Grayling ekstendera veoma zadovoljavajuća za krioprezervaciju i skladištenje sperme linjaka

Uspešnost sperme linjaka (Tinca Tinca L., 1758) nakon krioprezervacije u oplodnji i izleganju

Tench Tinca tinca (L., 1758) is a fish species with big potential in aquaculture and for which there is a great interest for improving rearing and reproduction techniques. The aim of this study was to test the efficiency of different cryoprotectants (methanol and DMSO) and extenders (Kurokura 180 and Grayling) during sperm cryopreservation on fertilization and hatching rates. Cryopreserved sperm had significantly lower fertilization and hatching success than control group. Samples cryopreserved with Grayling extender had higher fertilization and hatching success, independently of the cryoprotectant used, therefore pointing out the significance of use of sugar-based extenders in the cryopreservation of tench sperm.Linjak Tinca tinca (L., 1758) je vrsta ribe sa velikim potencijalom u akvakulturi i interes za unapređenjem tehnika za njeno gajenje rastu tokom proteklih decenija. Cilj ovog rada bio je testiranje uticaja različitih krioprotektanata (metanol i DMSO) i ekstendera (Kurokura 180 i Grayling) tokom krioprezervacije sperme na uspešnost oplodnje i izleganja kod linjaka. Sve eksperimentalne grupe su imale značajno niže vrednosti stepena oplodnje i izleganja od kontrole. Uzorci krioprezervirani sa Grayling ekstenderom su pokazali veću uspešnost oplodnje i izleganja bez obzira na korišćeni krioprotektant što ukazuje na značaj upotrebe ekstendera na šećernoj bazi u krioprezervaciji sperme ove vrste