Comparative Molecular Characterization of Ctnnb1- and Ha-ras-mutated Mouse Liver Tumors

Oncogene mutations in chemically induced mouse liver tumors strongly depend on the experimental regimen. Treatment of mice with a single dose of the genotoxin DEN mainly gives rise to Ha-ras- (~50%) or B-raf- (~20%) mutated tumors, in which the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is permanently activated. However, if DEN-treatment is followed by continuous application of the tumor promoter PB, selective proliferation of cells harboring activating mutations in Ctnnb1, which results in constitutive activation of the Wnt/beta-Catenin signaling pathway, is observed. The mechanisms of tumor promotion are still widely unsolved. Comprehensive molecular characterization of Ctnnb1- and Ha-ras-mutated mouse liver tumors was conducted with the goal of identifying tumor-specific differences that could help elucidate the molecular mechanism of PB and PB-like promoters. Analysis of large mRNA and miRNA (microRNA) expression, DNA methylation and protein expression/phosphorylation datasets using the novel bioinformatic data integration tool InCroMAP revealed characteristic changes in metabolism and signaling in the tumors, as well as tumor-specific differences. Most notably, mRNA data in Ctnnb1- but not Ha-ras-mutated tumors indicated that glucose is oxidatively metabolized in the TCA cycle. In contrast to Ctnnb1-mutated tumors, Ha-ras-mutated lesions displayed excessive production and trapping of cholesterol in the cell. Integration of miRNA, mRNA and protein data provided a possible mechanism for the down-regulation of glucose-6-phosphatase at the transcription and enzyme level in Ha-ras-mutated tumors, by which the transcription factor Stat3 transactivates miR-23a, which on its part targets and inhibits G6pc mRNA. Joint analysis of mRNA and protein data showed that Ha-ras-mutated tumors activate feedback mechanisms, which negatively regulate MAPK signaling, while Ctnnb1-mutated tumors show an activation of Wnt-inhibitory genes. Furthermore, the data supported a previously proposed crosstalk between the two signaling cascades mediated by dual-specificity phosphatases. The relevance of the lncRNA Meg3/Gtl2 in PB-mediated tumor promotion was investigated by qPCR measurements and in situ hybridization in Ctnnb1- and Ha-ras-mutated tumors as well as non-tumor control tissues. The main result of these experiments is that Meg3/Gtl2 was consistently and reproducibly up-regulated in all Ctnnb1-mutated tumors from PB-promoted mice but in none of the Ha-ras-mutated lesions from unpromoted animals. Together with the previous observation that Meg3/Gtl2 is increased in pericentral hypertrophic hepatocytes in PB-treated normal mouse liver, the described findings corroborate the relevance of this lncRNA as a predictive biomarker for PB-mediated tumor promotion. Ha-ras- and Ctnnb1-mutated tumors showed a ubiquitous reduction of methylation and hydroxymethylation at the 5’-position of cytidine relative to normal liver tissue, as determined by immunohistochemical staining. This suggests that global visual assessment of the DNA methylation and hydroxymethylation status is not suited as a means of stratification between the two tumor types. In conclusion, the data presented in this thesis underline that tumors harboring different oncogene mutations develop in part fundamentally different survival strategies. Comprehensive analysis of these substantial differences, including bioinformatic integration of large “omics” datasets, is extremely helpful in understanding the molecular processes that drive tumorigenesis and has led to identification of at least one promising new predictive biomarker for PB-mediated tumor formation.Der Onkogen-Mutationsstatus in chemikalieninduzierten Mauslebertumoren wird stark vom vorangegangen Behandlungsschema bestimmt. Werden Mäuse mit einer Einzeldosis des gentoxischen Initiators DEN behandelt, führt dies hauptsächlich zu Ha-ras- (~50%) oder B-raf- (~20%) mutierten Tumoren, in welchen der MAPK-Signalweg dauerhaft aktiviert ist. Folgt jedoch auf die DEN-Einzeldosis eine kontinuierliche Behandlung mit dem Tumorpromotor PB, wird selektives Auswachsen von Tumoren mit aktivierenden Mutationen im Ctnnb1-Gen beobachtet, welche zur konstitutiven Aktivierung des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs führen. Da die genaue Wirkungsweise von Tumorpromotoren weitgehend unbekannt ist, wurden Ctnnb1- und Ha-ras-mutierte Mauslebertumoren einer umfassenden molekularen Charakterisierung unterzogen. Ziel dessen war es, tumorspezifische Unterschiede aufzuzeigen, die ein genaueres Verständnis des molekularen Mechanismus von PB und PB-ähnlichen Promotoren ermöglichen. Mit Hilfe der neuentwickelten Datenintegrations-Software InCroMAP wurden große Datensätze, die mRNA- und miRNA (microRNA)-Expression, DNA-Methylierung sowie Proteinexpression und -phosphorylierung umfassten, zusammenhängend analysiert. Dabei wurden in den Tumoren charakteristische Veränderungen und tumorspezifische Unterschiede im Bezug auf Stoffwechsel und Signaltransduktion gefunden. Die mRNA-Daten deuteten insbesondere darauf hin, dass in Ctnnb1- aber nicht in Ha-ras-mutierten Tumoren Glucose oxidativ im Citratzyklus abgebaut wird. Außerdem zeigten Ha-ras-mutierte im Gegensatz zu Ctnnb1-mutierten Tumoren eine deutlich erhöhte Produktion und Speicherung von Cholesterin. Aus der Integration von miRNA-, mRNA- und Proteindaten ergab sich ein möglicher Mechanismus für die Inhibierung der Glucose-6-Phosphatase (G6pc) in Ha-ras-mutierten Tumoren auf Transkriptions- und Enzymnebene, im Zuge dessen der Transkriptionsfaktor Stat3 die Expression von miR-23a aktiviert, die ihrerseits das G6pc-Transkript und damit dessen Translation blockiert. In Ha-ras-mutierten Tumoren konnte auf mRNA- und Proteinebene die Aktivierung von Rückkopplungsmechanismen, die den MAPK-Signalweg negativ regulieren, gezeigt werden. In Ctnnb1-mutierten Tumoren wurde wiederum die Transaktivierung Wnt-inhibitorischer Gene festgestellt. Die Daten stützten des Weiteren das Modell einer durch dual-specificity-Phosphatasen vermittelten Wechselwirkung zwischen diesen beiden Signalwegen. Die Bedeutung der lncRNA Meg3/Gtl2 in der PB-vermittelten Tumorpromotion wurde mittels qPCR-Messungen und In-situ-Hybridisierung in Ctnnb1- und Ha-ras-mutierten Tumoren sowie nicht-mutierten Kontrollgeweben untersucht. Der eindeutige und reproduzierbare Befund dieser Experimente war, dass Meg3/Gtl2 in PB-promovierten Ctnnb1-mutierten, jedoch nicht in unpromovierten Ha-ras-mutierten Tumoren induziert wird. In Anbetracht vorangegangener Experimente, in denen Meg3/Gtl2-Transkription durch PB-Behandlung in den perizentralen hypertrophen Zellen in Mäusenormalleber aktiviert werden konnte, untermauern die beschriebenen Ergebnisse die Bedeutung dieser lncRNA als prädiktiven Biomarker für PB-vermittelte Tumorpromotion. In immunhistochemischen Färbungen wurde eine flächendeckende Reduktion der Methylierung und Hydroxymethylierung an der 5’-Position von Cytidin sowohl in Ha-ras- als auch Ctnnb1-mutierten Tumoren demonstriert. Dies deutet darauf hin, dass die globale visuelle Erfassung von DNA-Methylierung und -Hydroxymethylierung sich nicht zur Unterscheidung von Ha-ras- und Ctnnb1-mutierten Tumoren eignet. Zusammenfassend unterstreichen die in dieser Arbeit präsentierten Daten die Tatsache, dass Tumore mit unterschiedlichen Onkogenmutationen teilweise grundlegend verschiedene Überlebensstrategien entwickeln. Die umfassende Analyse dieser beträchtlichen Unterschiede, unter anderem durch bioinformatische Integration großer “-omik”-Datensätze, ist extrem hilfreich für das Verständnis der molekularen Vorgänge, welche die Tumorgenese antreiben, und hat zur Identifikation mindestens eines neuen vielversprechenden prädiktiven Biomarkers für PB-vermittelte Tumorbildung geführt