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Regulation der AktivitĂ€t der platelet-type 12-Lipoxygenase in Thrombozyten unter besonderer BerĂŒcksichtigung geschlechtsspezifischer EinflĂŒsse
The first mammalian lipoxygenase to be discovered in 1974 was platelet-type 12-lipoxygenase (p12-LO) which was named for the site of its discovery. It belongs to a large family of non-heme dioxygenases including 5-lipoxygenase responsible for leukotriene biosynthesis. Although p12-LO was the first lipoxygenase in mammals to be discovered and research has been going on since the discovery, only very little is known about regulation of activity. Involvement in cancer, angiogenesis, hypertension and platelet activation could be attributed to p12-LO activity and its metabolite 12-HETE and suggests the necessity of intensified research. For this study a focus was put on probable regulation in a sex dependent manner, as androgens had recently been found to be involved in regulation of 5-LO and leukotriene biosynthesis. Additionally, in particular for cardiovascular diseases a gender bias with higher incidence in male has been a long established fact, so a possible sex dependent regulation of p12-LO was proposed.
To explore p12-LO regulation in general and to elucidate possible sex dependent regulation in particular, a characterisation of p12-LO regulation in platelets was attempted in this work with two different approaches.
One, gender differences in regulation of p12-LO and possible influences of sex hormones were investigated. Two, common pharmacological tools, CDC and MK-886, were used to elucidate possible properties of p12-LO in intact cells.
Platelet 12-lipoxygenase is not differently active between the two sexes whether in non-stimulated and stimulated platelets was essentially the same. No differences were manifest in release of AA, subcellular localisation, translocation pattern or protein amount of p12-LO compared in platelets from male and female donors. However, a slight tendency towards lower product formation in female platelets was observed.
A strong spontaneous p12-LO activity was measured in non-stimulated platelets and metabolic activity continued over log time periods. p12-LO activity could strongly be enhanced by platelet stimulation with thrombin, collagen, A23187 and arachidonic acid. However, a direct induction of p12-LO activity by these agonists seems improbable. Platelet stimulation rather strongly increases the amount of available substrate for p12-LO as cPLA2 is activated and AA released than activates p12-LO itself.
p12-LO activity was potently and selectively suppressed to a basal level by addition of 1 to 3 ”M progesterone in a fast and non-genomic manner. Application of the other sex hormones estradiol and DHT failed to show an effect on p12-LO activity. Only p12-LO was affected by progesterone, other enzymes metabolizing AA as cPLA2 and COX-1 were not affected in any circumstances. [Ca2+]i levels, platelet aggregation, subcellular localisation and translocation pattern of p12-LO were not influenced by progesterone. A direct inhibition of p12-LO by progesterone could furthermore be excluded as no progesterone effect could be observed in homogenate incubations.
p12-LO activity is not complete blocked by progesterone but only suppressed to a basal level supporting evidence for p12-LO role as a âhouse-keepingâ enzyme in physiological contexts.
Surprisingly, the hormone progesterone normally acting on genomic levels affects its target enzyme p12-LO in anucleate cells, in platelets. Progesterone impairs p12-LO activity in a rapid, reversible manner as opposed to classical genomic actions. This progesterone effect is possibly mediated by a novel progesterone receptor (mPR) localized in the platelet membranes. Regulation pathways could be identified to involve activation of PKA and ascertain a negative, deactivating regulation of p12-LO activity in stimulated and in non-stimulated cells. PKA most likely converts its influence on p12-LO possibly by phosphorylation of the enzyme as p12-LO contains a phosphorylation motif for PKA.
In vivo progesterone levels reached during pregnancy overlap with effective progesterone concentrations for an inhibition of p12-LO in vitro (0.3 to 1 ”M). Attempts to transfer in vitro findings to in vivo conditions showed that progesterone could slightly suppress p12-LO activity in male PRP. Moreover, p12-LO activity in PRP prepared from pregnant females was lower than in controls from male and female. Both findings support an in vivo relevance for the progesterone regulation of p12-LO activity although progesterone probably contributes only marginally to regulation of p12-LO, so more complex mechanisms adding to this effect should be expected.Die erste in SĂ€ugetieren gefundene 12-Lipoxygenase wurde 1974 entdeckt und nach ihrem Entdeckungsort als platelet-type 12-Lipoxygenase (p12-LO) bezeichnet. Die postulierte Rolle der p12-LO und ihres Hauptproduktes 12-HETE in der Krebsentstehung, der Angiogeneseregulation und der Entstehung von Bluthochdruck sowie in der Regulation der Thrombozytenaktivierung macht die Notwendigkeit fĂŒr intensive Forschung deutlich. FĂŒr die vorliegende Arbeit wurde ein besonderer Augenmerk auf die mögliche geschlechtsabhĂ€ngige Regulation der p12-LO gerichtet, da kĂŒrzlich fĂŒr das verwandte Enzym 5-LO eine AktivitĂ€tsregulation und damit eine Regulation der Leukotrienbiosynthese durch Androgene beschrieben wurde. Da fĂŒr kardiovaskulĂ€re Erkrankungen, bei welchen ein geschlechtsabhĂ€ngiges Ungleichgewicht in der Inzidenz bekannt ist, ein EinfluĂ der p12-LO postuliert wird, wurde auch die p12-LO auf eine geschlechtsabhĂ€ngige Regulation untersucht.
Um die Regulation der p12-LO und mögliche EinflĂŒsse des Geschlechts auf die p12-LO zu untersuchen, wurden zum einen geschlechtsspezifische Unterschiede der p12-LO AktivitĂ€tsregulierung und mögliche direkte EinflĂŒsse von Geschlechtshormonen auf die p12-LO untersucht. Zum anderen kamen zwei pharmakologische Werkzeuge â CDC und MK-886 â zum Einsatz, um mögliche Regulationsmechanismen und Eigenschaften der p12-LO in intakten Thrombozyten zu beleuchten.
Beim Vergleich von mÀnnlichen und weiblichen Zellen weder Unterschiede im Bezug auf p12-LO AktivitÀt, AA-Freisetzung noch bei subzellulÀrer Lokalisation, Translokationsmustern oder Proteinmenge der p12-LO festgestellt werden.
In unstimulierten Thrombozyten wurde eine ausgeprĂ€gte spontane AktivitĂ€t der p12-LO gemessen, die kontinuierlich ĂŒber lĂ€ngere ZeitrĂ€ume anhielt. Diese basale AktivitĂ€t wurde durch Stimulation der Zellen mit Thrombin, Collagen, A23187 Ionophor oder AA deutlich verstĂ€rkt. Allerdings scheint eine direkte Aktivierung der p12-LO unwahrscheinlich, vielmehr erhöht die Thrombozytenaktivierung das Angebot an freier AA und damit die AktivitĂ€t der p12-LO deutlich, da durch die Stimulation die cPLA2 zur AA-Freisetzung angeregt wird.
Die AktivitĂ€t der p12-LO wird durch Zugabe von 1 bis 3 ”M Progesteron wirksam und selektiv auf einem basalen niedrigen Niveau gehalten. Der beobachtete Effekt tritt â anders als genregulatorische Effekte â schnell ein und ist reversibel. Behandlung der Zellen mit anderen Geschlechtshormonen wie Estradiol und DHT ergab keinen Effekt. Nur die p12-LO wird von Progesteron in seiner AktivitĂ€t beeinflusst, andere Enzyme des AA-Stoffwechsels wie cPLA2 und COX-1 werden in ihrer AktivitĂ€t nicht beeinfluĂt. IntrazellulĂ€re Calciumkonzentration, Thrombozytenaggregation, subzellulare Lokalisation und Translokation der p12-LO wurden von Progesteron nicht verĂ€ndert. Eine direkte Interaktion der p12-LO mit Progesteron konnte ausgeschlossen werden, da durch Progesteronzusatz zu Thrombozytenhomogenaten keine Inhibition der p12-LO beobachtet wurde.
Ăberraschenderweise kann das Hormon Progesteron, das seine Funktion auf genomischer Ebene erfĂŒllt, sein Zielenzym auch in kernlosen Zellen, den Thrombozyten, beeinflussen â und zwar in schneller, reversibler Weise, ganz anders als fĂŒr klassische genomische Effekte zu erwarten wĂ€re. Diese Wirkung des Progesterons wird vermutlich ĂŒber einen neuartigen Progesteronrezeptor (mPR) vermittelt, der in den Membranen der Thrombozyten lokalisiert sein könnte. Als Endpunkt der angestoĂenen Signalwege konnte die PKA als mögliche Effektorkinase identifiziert werden, die eine negative, deaktivierende Regulation der p12-LO in stimulierten und unstimulierten Thrombozyten sicherstellt. Höchstwahrscheinlich ĂŒbt PKA ihren Effekt auf p12-LO durch Phosphorylierung aus, die Sequenz der p12-LO enthĂ€lt ein entsprechendes Erkennungsmotiv fĂŒr die PKA.
Progesteron-Plasmaspiegel in vivo erreichen wĂ€hrend der Schwangerschaft Werte, die sich in vitro als effektive Konzentrationen zur p12-LO-Inhibition erwiesen hatten. Um mögliche in vivo Wirkungen des Progesterons abschĂ€tzen zu können, wurde Progesteron zu PRP von mĂ€nnlichen Spendern zugesetzt und die AktivitĂ€t der p12-LO vermessen. Eine leichte Hemmung der AktivitĂ€t wurde beobachtet. In PRP von schwangeren Spenderinnen konnte ebenfalls eine geringere AktivitĂ€t der p12-LO festgestellt werden. Beide Ergebnisse zeigen, dass auch in vivo eine Regulation der p12-Lo durch Progesteron in Betracht gezogen werden sollte. Allerdings ist zu erwarten, dass Progesteron nur einen kleinen Beitrag im Regulationsgeschehen leistet und darĂŒber hinaus komplexere Mechanismen an der Regulation der p12-LO beteiligt sind
Epigenetic activation of O-linked beta-N-acetylglucosamine transferase overrides the differentiation blockage in acute leukemia
Osteosarcopenia, an asymmetrical overlap of two connected syndromes
Osteoporosis and sarcopenia are two chronic conditions, which widely affect older people and share common risk factors. We investigated the prevalence of low bone mineral density (BMD) and sarcopenia, including the overlap of both conditions (osteosarcopenia) in 572 older hospitalized patients (mean age 75.1 10.8 years, 78% women) with known or suspected osteoporosis in this prospective observational multicenter study. Sarcopenia was assessed according to the revised definition of the European Working Group on Sarcopenia in Older People (EWGSOP2). Low BMD was defined according to the World Health Organization (WHO) recommendations as a T-score < â1.0. Osteosarcopenia was diagnosed when both low BMD and sarcopenia were present. Low BMD was prevalent in 76% and the prevalence of sarcopenia was 9%, with 90% of the sarcopenic patients showing the overlap of osteosarcopenia (8% of the entire population). Conversely, only few patients with low BMD demonstrated sarcopenia (11%). Osteosarcopenic patients were older and frailer and had lower BMI, fat, and muscle mass, handgrip strength, and T-score compared to nonosteosarcopenic patients. We conclude that osteosarcopenia is extremely common in sarcopenic subjects. Considering the increased risk of falls in patients with sarcopenia, they should always be evaluated for osteoporosis