Characterization of ScGup1 partners in the yeast putative Hedgehog-like morphogenic pathway

Tese de Doutoramento - Programa Doutoral em Biologia Molecular e Ambiental (Especialidade em Biologia Celular e Saúde)Saccharomyces cerevisiae Gup1 is a membrane bound O-acyltransferase firstly associated with glycerol uptake, and then involved in a wide range of cellular processes, including: (i) plasma membrane and cell wall composition, (ii) rafts assembly and integrity, (iii) lipid metabolism and GPI anchor remodeling, (iv) trafficking, (v) cytoskeleton polarization and budding pattern, (vi) telomere length, (vii) cell death, and (viii) ECM composition among others. Candida albicans Gup1 was also associated with morphogenesis and differentiation. The disruption of GUP1 in this pathogenic yeast reduces virulence, affecting its capacity to adhere/invade, to differentiate into hyphae and to form biofilms. Yeast Gup1 and Gup2 proteins in higher Eukaryotes, respectively HHATL and HHAT, are regulators of the morphogenic cell-cell signalling Hedgehog pathway. HHAT is responsible for the palmitoylation of the Hedgehog secreted morphogen, and HHATL for its negative regulation. The existence of a paracrine signaling pathway similar to Hedgehog was never described in microbial cells. However, unicellular organism can form large aggregates of cells like colonies or biofilms that have a tissue-like behavior, where cells differentiate, specialize, and spatially organize, supported by a complex saccharide and proteinatious ECM. Therefore, cell-cell communication must underlie these numerous communities. It remains unclear, however, whether this occurs through a diffusible chemical, like ammonia or quorum-sensing chemicals, or through a peptide signal like the Hh morphogen from higher Eukaryotes. The presence of a Gup/HHAT(L) protein in all Eukaryotes suggests a conserved mechanism in which these proteins might be involved. The main goal of this work was to identify and characterize the proteins interacting physically with Gup1 in S. cerevisiae, as a first step to disclose the function(s) of Gup proteins in yeast. Several proteins were previously suggested to putatively interact with Gup1, though only one did not arise from HTP surveys, the ammonium transceptor Mep2. In this work, two novel Gup1 physical interactions were found: the yeast outer mitochondrial membrane VDAC (Por1), and the eisosome core component Pil1. The interaction between Gup1 and the newly identified Por1 and Pil1 partners, as well as the previously identified Mep2, was studied: (i) the expression and localization of these partners was assessed by RT-PCR and GFP fluorescence respectively, and (ii) several processes commonly associated to Gup1 were evaluated phenotypically, for which purpose new single and double deleted strains were built.This work was supported by the strategic programme UID/BIA/04050/2013 (POCI-01-0145-FEDER- 007569) funded by national funds through the FCT I.P. and by the ERDF through the COMPETE2020 - Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI). Joana Tulha is a PhD student SFRH/BD/76025/2011 from FCT (Fundação para a Ciência e Tecnologia). Although the expression of neither Gup1 partner seems to be significantly altered by the deletion of GUP1, its absence affects the distribution of Por1, and Mep2. Importantly, the interaction between Gup1 and Por1, proved to be determinant for the nature of acetic acid-induced cell death, which changes from a necrosis-like program in Δgup1 cells, to what seems to be an apoptotic-like cell death in the absence of both proteins. In spite of the mitochondrial localization of Por1, its interaction with Gup1 is also important for the control of cell wall integrity, possible through the regulation CWI signaling, and for the differentiation of structured colonies and development of multicellular aggregates/mats. On the other hand, the interaction between Gup1 and the physical partner Pil1 seems to be important for the organization and/or stability of the plasma membrane. In the absence of Gup1, the number of eisosomes was reduced, suggesting an inefficient Pil1 assembly at the membrane, possibly related to the altered levels of phosphoinositide. Moreover, the absence of Pil1 increases the susceptibility of yeast cells to SDS, a phenotype that is exacerbated in Δgup1Δpil1 mutants. Finally, Gup1 and Mep2 seem to collaborate in the definition of cell wall composition/structure. Deletion of Mep2 in Δgup1 cells increases their sensitivity to some cell wall related stresses, suggesting that Mep2-associated transported and/or signaling could be important for cell survival when the cell wall is affected. Accordingly, both proteins appear to be essential to adherence/invasive growth of yeast cells. The work developed in this thesis represents the first systematic effort to identify Gup1 physical interactors, and a first step to understand the biological relevance and the niche of these interactions. Previous data suggest that yeast Gup1 is, or locates at, a hub between CWI, TORC1, TORC2/YPK, and HOG pathways. The present work results are compatible with this possibility, and highlight the intricate and complex role of Gup proteins in yeast cells, by showing that Gup1 interacts with mitochondrial, membrane and eisosomal proteins in the regulation of processes as different as cell death or plasma membrane and cell wall composition/organization.A proteína Gup1 de Saccharomyces cerevisiae é uma O-aciltransferase membranar, inicialmente associada ao transporte de glicerol e, mais tarde, a uma grande variedade de processos celulares, incluindo: (i) composição da membrana plasmática e parede celular, (ii) montagem e estabilidade de rafts, (iii) metabolismo de lípidos e remodelação de caudas GPI, (iv) tráfego intracelular, (v) polarização do citoesqueleto e padrão de gemulação, (vi) comprimento de telómeros, (vii) morte celular, e (viii) composição da matriz extracelular, entre outros. Em Candida albicans, a proteina Gup1 foi também associada à morfogénese e diferenciação. A deleção do GUP1 reduz a virulência desta levedura patogénica, afectando a sua capacidade para aderir/invadir, para se diferenciar em hifas e para formar biofilmes. Em Eucariotas superiores, as proteínas HHATL e HHAT, homólogos do Gup1 e do Gup2 de S. cerevisiae, respectivamente, são reguladores da via de sinalização Hedgehog. O HHAT é responsável pela palmitoilação do morfogéneo Hedgehog (Hh), enquanto o HHATL funciona como regulador negativo. A existência de uma via de sinalização semelhante à Hedgehog nunca foi descrita em células microbianas. Ainda assim, organismos unicelulares podem formar grandes agregados celulares, como colónias ou biofilmes, apresentando um comportamento semelhante ao de um tecido, nos quais as células se diferenciam, especializam e organizam espacialmente, suportadas por uma complexa matrix extracelular de natureza sacarídea e proteica. A comunicação intercelular deverá ser fundamental nestas comunidades. No entanto, é ainda desconhecido se esta comunicação ocorre através da difusão de compostos químicos, como a amónia ou quorum-sensing, ou através de um sinal peptídico, como o morfogéneo Hh de Eucariotas superiores. A existência de uma proteína Gup/HHAT(L) em todos os Eucariotas, sugere um mecanismo conservado no qual estas proteínas estarão envolvidas. Este trabalho teve como principal objectivo a identificação e caracterização de proteínas que interagem fisicamente com o Gup1 em S. cerevisiae, como primeiro passo para desvendar as funções do Gup1 em leveduras. Várias proteínas foram anteriormente identificadas como prováveis parceiros do Gup1, embora todas excepto uma, o transportador de amónio Mep2, tenham sido identificadas em ensaios HTP. Neste trabalho, foram identificadas duas novas interacções físicas com o Gup1: a proteína VDAC da membrana mitocondrial externa – Por1, e um componente dos eisossomas – Pil1. As interacções entre o Gup1 e estes parceiros, Por1 e Pil1, bem como a interacção com a Mep2, foram estudadas a nível de: (i) expressão e localização dos parceiros, avaliadas por RT-PCR e fluorescência de GFP, respectivamente; e (ii) de vários processos celulares associados ao Gup1, através de avaliação fenotípica. Apesar da expressão dos vários parceiros do Gup1 não ser significativamente alterada pela deleção do GUP1, a ausência desta proteína afecta a distribuição da Por1 e da Mep2. A interacção entre Gup1 e Por1 parece ainda ser determinante para definir a natureza da morte celular induzida por ácido acético, a qual altera de um processo do tipo necrótico em células Δgup1, para o que parece ser um processo do tipo apoptótico em células Δgup1Δpor1. Apesar da localização mitocondrial da Por1, a sua interacção com o Gup1 é ainda importante para o controlo da integridade da parede celular, possivelmente através da regulação da via de sinalização CWI, e para a diferenciação de colónias estruturadas e desenvolvimento de agregados multicelulares. Por outro lado, a interacção entre Gup1 e o parceiro Pil1 parece ser importante para a organização e/ou estabilidade da membrana plasmática. Na ausência do Gup1, o número de eisossomas é reduzido, sugerindo defeitos na associação da Pil1 à membrana. Para além disso, a ausência da Pil1 aumenta a susceptibilidade das células de levedura ao SDS, um fenótipo que é agravado no mutante Δgup1Δpil1. Finalmente, as proteínas Gup1 e Mep2 parecem colaborar na estabilidade da parede celular. A deleção do MEP2 em células Δgup1 aumenta a sensibilidade a alguns stresses associados à parede, o que sugere que o transporte e/ou sinalização através da Mep2 podem ser importantes para a sobrevivência celular quando a parede está afectada. Ambas as proteínas parecem ser ainda essenciais para a aderência/crescimento invasivo das células de levedura. O trabalho desenvolvido nesta tese consiste no primeiro esforço sistemático para identificar parceiros físicos do Gup1 no sentido de compreender a relevância biológica destas interacções. Trabalhos anteriores ”colocam” o Gup1 no cruzamento entre as vias CWI, TORC1, TORC2/YPK e HOG. Os resultados deste estudo são compatíveis com esta possibilidade, e destacam o papel complexo das proteínas Gup em leveduras, demonstrando a interacção do Gup1 com proteínas mitocondriais, da membrana plasmática e eisossomais na regulação de processos tão distintos quanto a morte celular ou a composição/organização da membrana ou parece celular

Characterization of ScGup1 partners in the yeast putative Hedgehog-like morphogenic pathway

Tese de Doutoramento - Programa Doutoral em Biologia Molecular e Ambiental (Especialidade em Biologia Celular e Saúde)Saccharomyces cerevisiae Gup1 is a membrane bound O-acyltransferase firstly associated with glycerol uptake, and then involved in a wide range of cellular processes, including: (i) plasma membrane and cell wall composition, (ii) rafts assembly and integrity, (iii) lipid metabolism and GPI anchor remodeling, (iv) trafficking, (v) cytoskeleton polarization and budding pattern, (vi) telomere length, (vii) cell death, and (viii) ECM composition among others. Candida albicans Gup1 was also associated with morphogenesis and differentiation. The disruption of GUP1 in this pathogenic yeast reduces virulence, affecting its capacity to adhere/invade, to differentiate into hyphae and to form biofilms. Yeast Gup1 and Gup2 proteins in higher Eukaryotes, respectively HHATL and HHAT, are regulators of the morphogenic cell-cell signalling Hedgehog pathway. HHAT is responsible for the palmitoylation of the Hedgehog secreted morphogen, and HHATL for its negative regulation. The existence of a paracrine signaling pathway similar to Hedgehog was never described in microbial cells. However, unicellular organism can form large aggregates of cells like colonies or biofilms that have a tissue-like behavior, where cells differentiate, specialize, and spatially organize, supported by a complex saccharide and proteinatious ECM. Therefore, cell-cell communication must underlie these numerous communities. It remains unclear, however, whether this occurs through a diffusible chemical, like ammonia or quorum-sensing chemicals, or through a peptide signal like the Hh morphogen from higher Eukaryotes. The presence of a Gup/HHAT(L) protein in all Eukaryotes suggests a conserved mechanism in which these proteins might be involved. The main goal of this work was to identify and characterize the proteins interacting physically with Gup1 in S. cerevisiae, as a first step to disclose the function(s) of Gup proteins in yeast. Several proteins were previously suggested to putatively interact with Gup1, though only one did not arise from HTP surveys, the ammonium transceptor Mep2. In this work, two novel Gup1 physical interactions were found: the yeast outer mitochondrial membrane VDAC (Por1), and the eisosome core component Pil1. The interaction between Gup1 and the newly identified Por1 and Pil1 partners, as well as the previously identified Mep2, was studied: (i) the expression and localization of these partners was assessed by RT-PCR and GFP fluorescence respectively, and (ii) several processes commonly associated to Gup1 were evaluated phenotypically, for which purpose new single and double deleted strains were built.This work was supported by the strategic programme UID/BIA/04050/2013 (POCI-01-0145-FEDER- 007569) funded by national funds through the FCT I.P. and by the ERDF through the COMPETE2020 - Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI). Joana Tulha is a PhD student SFRH/BD/76025/2011 from FCT (Fundação para a Ciência e Tecnologia). Although the expression of neither Gup1 partner seems to be significantly altered by the deletion of GUP1, its absence affects the distribution of Por1, and Mep2. Importantly, the interaction between Gup1 and Por1, proved to be determinant for the nature of acetic acid-induced cell death, which changes from a necrosis-like program in Δgup1 cells, to what seems to be an apoptotic-like cell death in the absence of both proteins. In spite of the mitochondrial localization of Por1, its interaction with Gup1 is also important for the control of cell wall integrity, possible through the regulation CWI signaling, and for the differentiation of structured colonies and development of multicellular aggregates/mats. On the other hand, the interaction between Gup1 and the physical partner Pil1 seems to be important for the organization and/or stability of the plasma membrane. In the absence of Gup1, the number of eisosomes was reduced, suggesting an inefficient Pil1 assembly at the membrane, possibly related to the altered levels of phosphoinositide. Moreover, the absence of Pil1 increases the susceptibility of yeast cells to SDS, a phenotype that is exacerbated in Δgup1Δpil1 mutants. Finally, Gup1 and Mep2 seem to collaborate in the definition of cell wall composition/structure. Deletion of Mep2 in Δgup1 cells increases their sensitivity to some cell wall related stresses, suggesting that Mep2-associated transported and/or signaling could be important for cell survival when the cell wall is affected. Accordingly, both proteins appear to be essential to adherence/invasive growth of yeast cells. The work developed in this thesis represents the first systematic effort to identify Gup1 physical interactors, and a first step to understand the biological relevance and the niche of these interactions. Previous data suggest that yeast Gup1 is, or locates at, a hub between CWI, TORC1, TORC2/YPK, and HOG pathways. The present work results are compatible with this possibility, and highlight the intricate and complex role of Gup proteins in yeast cells, by showing that Gup1 interacts with mitochondrial, membrane and eisosomal proteins in the regulation of processes as different as cell death or plasma membrane and cell wall composition/organization.A proteína Gup1 de Saccharomyces cerevisiae é uma O-aciltransferase membranar, inicialmente associada ao transporte de glicerol e, mais tarde, a uma grande variedade de processos celulares, incluindo: (i) composição da membrana plasmática e parede celular, (ii) montagem e estabilidade de rafts, (iii) metabolismo de lípidos e remodelação de caudas GPI, (iv) tráfego intracelular, (v) polarização do citoesqueleto e padrão de gemulação, (vi) comprimento de telómeros, (vii) morte celular, e (viii) composição da matriz extracelular, entre outros. Em Candida albicans, a proteina Gup1 foi também associada à morfogénese e diferenciação. A deleção do GUP1 reduz a virulência desta levedura patogénica, afectando a sua capacidade para aderir/invadir, para se diferenciar em hifas e para formar biofilmes. Em Eucariotas superiores, as proteínas HHATL e HHAT, homólogos do Gup1 e do Gup2 de S. cerevisiae, respectivamente, são reguladores da via de sinalização Hedgehog. O HHAT é responsável pela palmitoilação do morfogéneo Hedgehog (Hh), enquanto o HHATL funciona como regulador negativo. A existência de uma via de sinalização semelhante à Hedgehog nunca foi descrita em células microbianas. Ainda assim, organismos unicelulares podem formar grandes agregados celulares, como colónias ou biofilmes, apresentando um comportamento semelhante ao de um tecido, nos quais as células se diferenciam, especializam e organizam espacialmente, suportadas por uma complexa matrix extracelular de natureza sacarídea e proteica. A comunicação intercelular deverá ser fundamental nestas comunidades. No entanto, é ainda desconhecido se esta comunicação ocorre através da difusão de compostos químicos, como a amónia ou quorum-sensing, ou através de um sinal peptídico, como o morfogéneo Hh de Eucariotas superiores. A existência de uma proteína Gup/HHAT(L) em todos os Eucariotas, sugere um mecanismo conservado no qual estas proteínas estarão envolvidas. Este trabalho teve como principal objectivo a identificação e caracterização de proteínas que interagem fisicamente com o Gup1 em S. cerevisiae, como primeiro passo para desvendar as funções do Gup1 em leveduras. Várias proteínas foram anteriormente identificadas como prováveis parceiros do Gup1, embora todas excepto uma, o transportador de amónio Mep2, tenham sido identificadas em ensaios HTP. Neste trabalho, foram identificadas duas novas interacções físicas com o Gup1: a proteína VDAC da membrana mitocondrial externa – Por1, e um componente dos eisossomas – Pil1. As interacções entre o Gup1 e estes parceiros, Por1 e Pil1, bem como a interacção com a Mep2, foram estudadas a nível de: (i) expressão e localização dos parceiros, avaliadas por RT-PCR e fluorescência de GFP, respectivamente; e (ii) de vários processos celulares associados ao Gup1, através de avaliação fenotípica. Apesar da expressão dos vários parceiros do Gup1 não ser significativamente alterada pela deleção do GUP1, a ausência desta proteína afecta a distribuição da Por1 e da Mep2. A interacção entre Gup1 e Por1 parece ainda ser determinante para definir a natureza da morte celular induzida por ácido acético, a qual altera de um processo do tipo necrótico em células Δgup1, para o que parece ser um processo do tipo apoptótico em células Δgup1Δpor1. Apesar da localização mitocondrial da Por1, a sua interacção com o Gup1 é ainda importante para o controlo da integridade da parede celular, possivelmente através da regulação da via de sinalização CWI, e para a diferenciação de colónias estruturadas e desenvolvimento de agregados multicelulares. Por outro lado, a interacção entre Gup1 e o parceiro Pil1 parece ser importante para a organização e/ou estabilidade da membrana plasmática. Na ausência do Gup1, o número de eisossomas é reduzido, sugerindo defeitos na associação da Pil1 à membrana. Para além disso, a ausência da Pil1 aumenta a susceptibilidade das células de levedura ao SDS, um fenótipo que é agravado no mutante Δgup1Δpil1. Finalmente, as proteínas Gup1 e Mep2 parecem colaborar na estabilidade da parede celular. A deleção do MEP2 em células Δgup1 aumenta a sensibilidade a alguns stresses associados à parede, o que sugere que o transporte e/ou sinalização através da Mep2 podem ser importantes para a sobrevivência celular quando a parede está afectada. Ambas as proteínas parecem ser ainda essenciais para a aderência/crescimento invasivo das células de levedura. O trabalho desenvolvido nesta tese consiste no primeiro esforço sistemático para identificar parceiros físicos do Gup1 no sentido de compreender a relevância biológica destas interacções. Trabalhos anteriores ”colocam” o Gup1 no cruzamento entre as vias CWI, TORC1, TORC2/YPK e HOG. Os resultados deste estudo são compatíveis com esta possibilidade, e destacam o papel complexo das proteínas Gup em leveduras, demonstrando a interacção do Gup1 com proteínas mitocondriais, da membrana plasmática e eisossomais na regulação de processos tão distintos quanto a morte celular ou a composição/organização da membrana ou parece celular

Online model estimation for predictive control of air conditioners in buildings.

The foreseen deployment of advanced building automation technologies promises to turn passive consumers into active prosumers. Building automation technologies include communication, monitoring and control functionalities. These technologies can render great benefits to the power systems by increasing the flexibility of the demand side. Demand flexibility is widely acknowledged as a solution to increase the integration of the renewable energy sources, improve the operation of the transmission and distribution networks, and enhance the economic effectiveness of electricity markets.The aim of this Master thesis is to develop mathematical models to exploit the net load flexibility of corporate buildings with the objective of minimizing energy cost. This includes the development of simplified data-driven thermal models and decision aid tools to optimize the operation of distributed energy resources (e.g., HVAC) in buildings. The proposed tools will be developed within the framework of the European project GREsBAS and will be tested in a demo site (INESC TEC)

Saccharomyces cerevisiae glycerol/H+ symporter Stl1p is essential for cold/near-freeze and freeze stress adaptation. A simple recipe with high biotechnological potential is given

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Freezing is an increasingly important means of preservation and storage of microbial strains used for many types of industrial applications including food processing. However, the yeast mechanisms of tolerance and sensitivity to freeze or near-freeze stress are still poorly understood. More knowledge on this regard would improve their biotechnological potential. Glycerol, in particular intracellular glycerol, has been assigned as a cryoprotectant, also important for cold/near-freeze stress adaptation. The <it>S. cerevisiae </it>glycerol active transporter Stl1p plays an important role on the fast accumulation of glycerol. This gene is expressed under gluconeogenic conditions, under osmotic shock and stress, as well as under high temperatures.</p> <p>Results</p> <p>We found that cells grown on <it>STL1 </it>induction medium (YPGE) and subjected to cold/near-freeze stress, displayed an extremely high expression of this gene, also visible at glycerol/H⁺symporter activity level. Under the same conditions, the strains harbouring this transporter accumulated more than 400 mM glycerol, whereas the glycerol/H⁺symporter mutant presented less than 1 mM. Consistently, the strains able to accumulate glycerol survive 25-50% more than the <it>stl1Δ </it>mutant.</p> <p>Conclusions</p> <p>In this work, we report the contribution of the glycerol/H⁺symporter Stl1p for the accumulation and maintenance of glycerol intracellular levels, and consequently cell survival at cold/near-freeze and freeze temperatures. These findings have a high biotechnological impact, as they show that any <it>S. cerevisiae </it>strain already in use can become more resistant to cold/freeze-thaw stress just by simply adding glycerol to the broth. The combination of low temperatures with extracellular glycerol will induce the transporter Stl1p. This solution avoids the use of transgenic strains, in particular in food industry.</p

Programmed cell death processes in Saccharomyces cerevisiae are altered by GUP1 deletion

During the past years, yeast has been successfully established as a model to study mechanisms of programmed cell death regulation. Saccharomyces cerevisiae commits to cell death showing typical hallmarks of metazoan apoptosis, in response to different stimuli. Gup1p, an O-acyltransferase, is required for several cellular processes that are related to apoptosis development, such as rafts integrity and stability, lipid metabolism including GPI anchor correct remodeling, proper mitochondrial and vacuole function, bud site selection and actin dynamics. We used two known apoptosis inducing conditions, chronological aging and acetic acid, to assess several apoptotic markers in gup1∆ mutant strain. We found that this mutant presents a significantly reduced chronological life span, comparing to Wt and it is also highly sensitive to acetic acid treatment. Although both chronological aging and acetic acid lead to identical effects, the differences between the strains in the levels/types of apoptotic markers are notorious. In addition, ROS levels of gup1∆ mutant strain were extremely high. According to our results, cells lacking GUP1 seem to be incapable of undergoing apoptosis. Instead this mutant appears to be experiencing a necrotic cell death process. Gup1p has been described to have an important function on lipid rafts assembly/integrity as well as on cell lipid profile. On the other hand, in the literature, rafts have been increasingly implicated on apoptotic signaling. The present results reinforce such idea.Este trabalho é financiado por Fundos FEDER através do Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE e por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do projecto PEst-C/BIA/UI4050/201

O jornalismo sentado e a dependência das agências: o caso da secção de Desporto do jornal PÚBLICO

Relatório de Estágio apresentado para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em JornalismoElaborado no âmbito do Mestrado em Jornalismo, este relatório procura conjugar a experiência prática de três meses na secção de Desporto do jornal PÚBLICO com uma reflexão sobre a progressiva sedentarização do jornalismo que se vive atualmente e todas as consequências que daí advêm: a dependência das agências de notícias, a perda do contacto direto com as fontes, a progressiva uniformização da informação, entre outras. Partindo de uma base teórica (revisão de literatura) para uma análise prática (pela realidade constatada no PÚBLICO), este trabalho é, no fim de contas, uma espécie de prova dos factos de uma tendência que, ao longo dos anos, tem vindo a ser apregoada e criticada pelos estudiosos do jornalismo

Study of the influence of lipid rafts in acetic acid-induced apoptosis

Dissertação de mestrado em Genética MolecularLipid rafts are sphingolipid-sterol rich micro-domains of the plasma membrane that have been associated with different cellular processes, including apoptosis. During the past years, yeast has been successfully established as a model to study mechanisms of programmed cell death in mammalian cells. Saccharomyces cerevisiae commits to cell death showing typical hallmarks of metazoan apoptosis in response to different stimuli. Gup1p, a pleiotropic O-acyltransferase first associated with glycerol metabolism and transport, is involved in lipid metabolism, rafts integrity and assembly, as well as in GPI anchor remodeling, among a wide range of cellular processes. While Gpd1p/Gpd2p are the two isoforms of glycerol-3-phosphate dehydrogenase that have a prime role in the production of glycerol, Rvs161p is a lipid raft protein mainly involved in the regulation of actin cytoskeleton polarization and secretory vesicle trafficking. Actin cytoskeleton together with vesicle trafficking have been suggested to play a crucial role in yeast apoptosis. Therefore, it is conceivable that lipid rafts may also play a role in yeast cell death and understanding their function in such process in yeast may provide further insights on their role in mammalian apoptosis. For this purpose we used two known apoptosis inducing conditions, chronological aging and acetic acid, and analyzed several apoptotic markers in Δgup1, Δgpd1Δgpd2 and Δrvs161 mutant strains. We found that Δgup1 presents a significantly reduced chronological life span as compared to Wt and is also highly sensitive to acetic acid treatment. According to the apoptotic markers analyzed, cells lacking GUP1 seem to be incapable of undergoing apoptosis. Instead this mutant appears to be experiencing a necrotic cell death process. The Δgpd1Δgpd2 (but not single mutants) and Δrvs161 mutant strains are also sensitive to acetic acid. However, the apoptotic markers examined suggest that these mutants die by apoptosis, differently from that we observed for gup1 mutant. The ergosterol distribution in Wt and in the acetic acid-sensitive mutant strains gup1, Δgpd1Δgpd2 and Δrvs161 was subsequently observed by filipin staining. An altered ergosterol distribution was visualized in all mutants studied, particularly in gup1 mutant. We also observed that acetic acid induces a rearrangement in the distribution of ergosterol. Altogether, our results indicate that lipid rafts seems to be a key component in apoptotic induction/signaling, probably even essential in some circumstances for the correct development of apoptosis in yeast.Os rafts, domínios da membrana plasmática ricos em esfingolípidos e ergosterol, têm sido associados com diversos processos celulares, incluindo a apoptose. Nos últimos anos, a levedura tem sido aceite como um bom modelo para o estudo dos mecanismos de regulação da morte celular programada. Vários estudos demostraram que, em resposta a diferentes estímulos, a levedura Saccharomyces cerevisiae apresenta uma morte celular com os fenótipos típicos da apoptose de mamíferos. A proteína Gup1p, uma O-aciltransferase anteriormente associada com o metabolismo e transporte de glicerol, está envolvida, de entre vários processos, no metabolismo lipídico, na arquitectura/integridade dos rafts, assim como na remodelação das âncoras GPI. As proteínas Gpd1p/Gpd2p são duas isoformas da glicerol-3-fosfatodesidrogenase, enzima responsável pela produção do glicerol. O Rvs161p é uma proteína dos rafts envolvida na regulação da polarização da actina e no tráfego de vesículas. Os filamentos de actina assim como o trafego de vesículas têm sido apontados como importantes intervenientes na apoptose em leveduras. Assim, é possível que os rafts exerçam um papel importante na morte celular em leveduras. O conhecimento da sua função neste processo poderá ajudar a compreender a importância dos rafts neste tipo de morte celular em mamíferos. Para estudar esta hipótese, foram analisados diferentes marcadores apoptóticos nos mutantes Δgup1, Δgpd1Δgpd2 e Δrvs161, em duas condições indutoras de apoptose, o envelhecimento cronológico e o tratamento com ácido acético. Verificamos que, quando comparado com a Wt, este mutante apresenta uma redução significativa na longevidade sendo também extremamente sensível ao ácido acético. Os marcadores apoptóticos estudados indicam que as células deletadas no gene GUP1 são incapazes de morrer por apoptose. Nas condições mencionadas, a estirpe Δgup1 parece morrer por necrose. Os mutantes Δgpd1Δgpd2 (mas não os mutantes simples) e Δrvs161 são também sensíveis ao ácido acético. Contrariamente ao que se observou para o mutante gup1, estes mutantes morrem por apoptose. Por último, examinou-se a distribuição do ergosterol nos mutantes sensíveis ao ácido acético. Observou-se alterações na sua distribuição em todos os mutantes, particularmente o mutante gup1. Verificou-se também que o tratamento com ácido acético induz um reorganização da distribuição do ergosterol. De um modo geral, os resultados obtidos sugerem que os rafts exercem uma função determinante na indução/sinalização da apoptose, sendo portanto, a sua integridade essencial no desencadear do processo apoptótico.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Projeto da FCT (FCOMP-01-0124-FEDER-007047

Fatores que influenciam o consumidor na compra de produtos de papelaria

A presente investigação tem como objetivo geral investigar quais os fatores que mais influenciam os consumidores no processo de tomada de decisão na compra de produtos de papelaria. Nesse sentido, a pesquisa está fundamentada em diversas teorias e fatores que impactam o comportamento de compra do consumidor, bem como o processo de decisão de compra. Relativamente à metodologia, foi realizada uma metodologia quantitativa a partir da recolha de dados por meio de questionário para obtenção de dados, utilizando o SPSS, nos quais geraram análises de gráficos baseadas em linhas teóricas fundamentadas para esta investigação. Através das análises pretende-se evidenciar que fatores mais impactam no comportamento de compra do consumidor de papelaria. Posto isto, após as análises, foram sugeridas estratégias para as empresas que atuam no ramo de papelaria se destacarem no mercado

Dating violence: Women who broke it off permanently

Dating violence is defined as a dyadic interaction involving the perpetration or threat of a violence, which, to include psychological violence prevents the victim from leaving the abusive relationship. However, some women can break it off and keep off permanently. This research aims to analyze the social representations and perspectives of young women who were victims of dating violence and ended their relationship by their own initiative, permanently.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Percepção da Usabilidade do Moodle como Ferramenta para o Ensino de Ciências Baseado em Investigação

Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina, Campus Araranguá. Graduação em Tecnologias da Informação e Comunicação.Este trabalho tem como finalidade verificar a usabilidade de um modelo de Sequência Didática desenvolvido baseado na metodologia de ensino investigativo, por meio de um Ambiente Virtual de Aprendizagem, sendo escolhida a plataforma Moodle. O objetivo deste espaço educacional é representar apoio à aprendizagem, a fim de facilitar e intensificar o desenvolvimento de atividades baseadas em investigação, além da interação entre discentes e docentes. Visando isto, foram desenvolvidos cursos no formato de Sequências Didáticas baseadas no modelo de ensino de ciências baseado em investigação em um Ambiente Virtual de Aprendizagem. Para o desenvolvimento desta pesquisa, foi realizada uma revisão bibliográfica sobre os temas chaves, tendo como os autores Belloni (2012), Moran (2012), Nielsen (1994), Otto Peters (1983), como principal embasamento teórico. Para a percepção da experiência dos discentes e docentes sobre a usabilidade do sistema criado, foram desenvolvidos dois inquéritos diferentes baseados no modelo Tecnologia, Usabilidade e Pedagogia, os quais foram aplicados no final de cada curso. Deste modo, esta pesquisa é classificada como de caráter exploratório, aplicada, abordando o problema como uma pesquisa qualitativa. Esta pesquisa foi efetuada em duas instituições públicas de ensino básico das cidades de Araranguá e Balneário Arroio do Silva, o Instituto Federal de Santa Catarina e a Escola de Educação Básica Apolônio Ireno Cardoso, respectivamente. Foi realizado um censo com turmas do ensino médio totalizando 129 discentes, sendo 58 do primeiro ano da E.E.B. Apolônio Ireno Cardoso, 30 do terceiro ano e 41 do quarto ano do IFSC, além de uma docente de cada uma das instituições de ensino. Conclui-se que o uso da plataforma e das redes sociais para realização do cadastro teve uma boa receptividade com relação aos discentes, apresentando diversos pontos positivos, e atenderam suas necessidades. A partir da percepção dos docentes com relação as suas experiências trouxe sugestões de melhorias, como o desenvolvimento de cursos mais curtos, além da falta de infraestrutura na escola, disponibilidade de laboratórios de informática, Internet de baixa qualidade e ausência de suporte técnico.This work aims to verify the usability of a new instructional sequence model developed based on an investigative teaching methodology through a virtual learning environment; Moodle being the chosen platform. The objective of the studied educational space is to demonstrate support to learning when it facilitates and intensifies the development of activities based on research as well as the teacherstudent interaction. Accordingly, courses following the Didactic Sequence focusing on science teaching were created in this study. For the development of this research, a literature review of the key issues was conducted. The authors Belloni (2012), Moran (2012), Nielsen (1994), Otto Peters (1983) were the main theoretical basis. This study developed two surveys based on a Technology, Usability and Pedagogy model focusing on how teachers and students perceive the use of the created system applied at the end of each course. Hence, this research is classified as exploratory with a quantitative research approach. This research was conducted in two public institutions of basic education in Brazil; the Federal Institute of Santa Catarina, in Araranguá and the School of Basic Education Apolônio Ireno Cardoso, in Balneário Arroio do Silva. A total of 129 High School students took the surveys; 58 first year students from the School of Basic Education Apolônio Ireno Cardoso, 30 third year and 41 fourth year students from the Federal Institute of Santa Catarina, the survey was also taken by one teacher from each educational institution. The findings show that using the developed platform and social networks to enroll the participants had a good receptivity amongst the students, presenting several positive figures and being suitable to their needs. From the teachers' perspective regarding their experiences, suggestions of improvements were made, such as the development of shorter courses, highlighting the lack of infrastructure in the schools, availability of computer labs, poor Internet connection and the scarcity of technical support