Mutations at positions 186 and 194 in the HA gene of the 2009 H1N1 pandemic influenza virus improve replication in cell culture and eggs

Obtaining suitable seed viruses for influenza vaccines poses a challenge for public health authorities and manufacturers. We used reverse genetics to generate vaccine seed-compatible viruses from the 2009 pandemic swine-origin influenza virus. Comparison of viruses recovered with variations in residues 186 and 194 (based on the H3 numbering system) of the viral hemagglutinin showed that these viruses differed with respect to their ability to grow in eggs and cultured cells. Thus, we have demonstrated that molecular cloning of members of a quasispecies can help in selection of seed viruses for vaccine manufacture

Untersuchungen zur GLP-1-(Glucagon-like peptide-1) induzierten Signaltransduktion und Genexpression an der pankreatischen ß-Zellinie INS-1.

Das Darmhormon Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) ist ein vielversprechendes Therapeutikum in der Behandlung des Typ 2-Diabetes. Allerdings liegen nur wenige Daten über die molekulare Wirkung des Hormons vor. Daher wurden die intrazellulären Effekte, die GLP-1-induzierten Signaltransduktion und Genexpression am Beispiel der pankreatischen ß-Zellinie INS-1 untersucht. In den INS-1-Zellen zeigte sich nach einer GLP-1-Stimulation eine zeit-, dosis- und glukose-abhängige Phosphorylierung von ERK1/2 bzw. der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Elk-1 und CREB. Während GLP-1 die beiden Signalmoleküle bereits nach wenigen Minuten transient aktivierte, führte Glukose zu einer verzögerten, aber anhaltenden Aktivierung. Beide Stimulanzien gemeinsam bewirkten eine synergistische Aktivierung von ERK1/2 und CREB. Sowohl am Mechanismus der glukose- als auch GLP-1-induzierten Aktivierung sind Ca2[plus]-regulierte Signalprozesse in antagonistischer Weise involviert. So führte die Inhibition von CaM-Kinasen und der intrazellulären Ca2[plus]-Erhöhung zu einer Reduktion der GLP-1- und glukosestimulierten ERK1/2-Phosphorylierung, die induzierte Aktivierung von CREB wurde leicht verstärkt. Die Inhibition der PKA und MEK ließen die Rückschlüsse zu, daß die Aktivie-rung der MAPK-Kaskade teilweise durch die PKA vermittelt wird und eine Wechselwirkung zwischen den Kaskaden existiert. Insbesondere die Induktion der frühen Gene junB, c-fos, nur-77 und zif268, die mit der GLP-1-induzierten ERK1/2- und CREB-Phosphorylierung korrelierten, belegten, daß GLP-1 einen Teil seiner Wirkung über diese Signalwege vermittelt. Die Glukosewirkung hinsichtlich der IEG-Induktion war gering. Beide Stimuli gemeinsam führten analog zum synergistischen Effekt auf signaltransduktorischer Ebene zu einer gesteigerten und verlängerten IEG-Expression, die somit die physiologische Bedeutung von GLP-1 als Glukosekompetenzfaktor unterstrichen

Evidence for an RNA chaperone function of polypyrimidine tract-binding protein in picornavirus translation

The cellular polypyrimidine tract-binding protein (PTB) is recruited by the genomic RNAs of picornaviruses to stimulate translation initiation at their internal ribosome entry site (IRES) elements. We investigated the contribution of the individual RNA recognition motif (RRM) domains of PTB to its interaction with the IRES of foot-and-mouth disease virus (FMDV). Using a native gel system, we found that PTB is a monomer, confirming recent reports that challenged the previous view that PTB is a dimer. Mapping the spatial orientation of PTB relative to the bound IRES RNA, we found that the two C-terminal RRM domains III and IV of PTB bind in an oriented way to the IRES. Domain III contacts the IRES stem-loop 2, while domain IV contacts the separate IRES 3′ region. PTB domain I appears not to be involved directly in RNA binding, but domain II stabilizes the RNA binding conferred by domains III and IV. A PTB protein containing only these two C-terminal PTB domains is sufficient to enhance the entry of initiation factor eIF4G to the IRES and stimulate IRES activity, and the long-lived PTB–IRES interaction stabilized by domain II is not a prerequisite for this function. Thus, PTB most likely acts as an RNA chaperone to stabilize IRES structure and, in that way, augment IRES activity

Human RNA Polymerase I-Driven Reverse Genetics for Influenza A Virus in Canine Cells ▿

We have established a human RNA polymerase I (pol I)-driven influenza virus reverse genetics (RG) system in the Madin-Darby canine kidney 33016-PF cell line, which is approved for influenza vaccine manufacture. RNA pol I polymerases are generally active only in cells of species closely related to the species of origin of the polymerases. Nevertheless, we show that a nonendogenous RNA pol I promoter drives efficient rescue of influenza A viruses in a canine cell line. Application of this system allows efficient generation of virus strains and presents an alternative approach for influenza vaccine production