BIỂU HIỆN GEN XBXS14 MÃ HÓA XYLAN 1,4-Β-XYLOSIDASE CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI KHUẨN RUỘT MỐI COPTOTERMES GESTROI TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI ROSETTA (DE3)

Khung đọc mở GL0112518 gồm 1077 nucleotide (còn gọi là Xbxs14) mã hóa xylan 1,4-β-xylosidase kiềm đã được khai thác từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome của vi sinh trong ruột mối. Gen được tổng hợp nhân tạo và gắn vào vector pET22b(+) để tiến hành biểu hiện enzyme dạng tái tổ hợp cho đánh giá tính chất nzyme. Kết quả cho thấy gen được biểu hiện tốt trong ba chủng E. coli BL21, Rosetta (DE3) và JM109 (DE3), trong đó hai chủng E. coli BL21, Rosetta (DE3) thu được sinh khối lớn nhưng hầu hết enzyme nằm ở pha không tan. Bằng cách thay đổi điều kiện biểu hiện bao gồm nồng độ chất cảm ứng IPTG, nhiệt độ nuôi cấy biểu hiện gen và thời gian thu mẫu, một phần nhỏ enzyme đã được biểu hiện ở dạng tan. Điều kiện thích hợp cho việc biểu hiện Xbxs14 trong chủng E. coli Rosetta (DE3) là nuôi cấy lắc trong môi trường LB, cảm ứng ở IPTG 0,05 mM, nhiệt độ 20oC trong 2 ngày. Enzyme tái tổ hợp được biểu hiện ở pha tan (soluble fraction) có hoạt tính của xylosidase, phân cắt liên kết β(1→4) glycoside ở cơ chất pNPX tạo màu vàng đặc trưng của nitrophenyl. Trong 1 lít môi trường nuôi cấy thu được 3,15 U enzyme

XÂY DỰNG PROBE ĐỂ KHAI THÁC VÀ CHỌN GEN MÃ HÓA XYLAN 1-4 BETA XYLOSIDASE TỪ DỮ LIỆU GIẢI TRÌNH TỰ DNA METAGENOME

Theo phân loại của CAZy, xylan 1-4 beta xylosidase thuộc họ glycoside hydrolase (GH) 1, 3, 31, 39, 43,51, 52, 54, 116, 120. Trong nghiên cứu này, probe được xây dựng dựa trên các trình tự axit amin của enzyme này từ mỗi họ GH đã được nghiên cứu trong thực nghiệm. Các trình tự thu thập để xây dựng probe đảm bảo cùng có nguồn gốc từ vi khuẩn, có các thông tin chi tiết về hoạt tính enzyme, nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu. Kết quả các họ GH1, GH3 chỉ tìm được duy nhất 01 trình tự, GH52 tìm được 3 trình tự và GH43 tìm được 11 trình tự đáp ứng các tiêu chí thu thập. Với kết quả tìm kiếm này, chỉ có duy nhấthọ GH43 có đủ số lượng trình tự đáng tin cậy để xây dựng probe. Probe của họ GH43 có độ dài là 507 amino acid, trong đó chứa toàn bộ 7 amino acid hoàn toàn giống nhau ở các trình tự, 32 vị trí giống nhau ở đa số các trình tự và có 30 vị trí giống nhau ở một số trình tự, với độ bao phủ thấp nhất là 60% và độ tương đồng thấp nhất là 30%, điểm tối đa là 17. Sử dụng probe này đã khai thác được 25 trình tự mã hóa xylan 1-4 beta xylosidase từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome của vi sinh vật sống tự do trong ruột mối. So sánh với kết quả chú giải gen dựa trên dữ liệu KEGG của BGI chỉ có 20 trình tự trùng nhau. Kết quả ước đoán cấu trúc bậc ba của các trình tự cho thấy tất cả các trình tự có chỉ số điểm tối đa khi so sánh với probe bằng BLASTP cao trên 100 đều có cấu trúc giống với cấu trúc của xylosidase đã được nghiên cứu. Như vậy, probe này có thể sử dụng để khai thác gen beta - xylosidase từ dữ liệu metagenome khi sử dụng chỉ số điểm tối đa trên 10

Tạo dòng tế bào hybridoma tiết kháng thể đơn dòng gây ngưng kết hồng cầu của người mang kháng nguyên A

The determination of ABO blood group is obliged in many cases especially before blood transfusion, that is indicated at Point a, Clause 4, Article 14 Circular 26/2013/TT-BYT - Vietnam, date 09.16.2013. For this purpose, both standard sera (monoclonal antibodies) and standard red blood cells are common used but monoclonal antibodies are prefered. In Vietnam, monoclonal antibodies against ABO blood group are not available in domestic production. In this study, we succeeded in the generation of hybidoma cells secreting anti-A monoclonal antibody. Firstly, Balb/c mice were injected with Vietnamese human group A red blood cells to evoke B lymphocyte cells against A antigen present on the surface of the red blood cells. Afterward the lymphocytes were fused with sp2/0 myeloma cells in the presence of polyethylene glycol (PEG) to gain hybrid cells that were identified through ability to expand cells in a selective medium (hypoxanthine aminopterine thymine - HAT) at 37°C and 5% CO2. During screening and isolation process, the positive clones were identified by agglutination test with standard group A red blood cells. Of the 1440 wells, 12 monoclonal hybrid clones were selected. The hybrid cell line (designated A6G11C9) was the best one secreting the highest anti-A monoclonal antibody into culture with the antibody titer of 512. The antibody showed good intensity (+++), and the agglutination was visible by 10 seconds. This antibody is the promising for ABO-grouping kit development.Xác định nhóm máu ABO là bắt buộc đối với người cho và người nhận máu trước khi truyền máu được quy định tại Điểm a, Khoản 4, Điều 14 của Thông tư 26/2013/TT-BYT, ngày 16/9/2013. Theo đó, nhóm máu ABO phải được xác định bằng phương pháp huyết thanh mẫu và hồng cầu mẫu. Trong xét nghiệm y tế hiện nay người ta sử dụng kháng thể đơn dòng kháng A để xác định hồng cầu mang kháng nguyên A trên bề mặt. Cho đến nay, đã có nhiều công ty sản xuất và thương mại kháng thể đơn dòng kháng A trên thế giới, tuy nhiên chưa có đơn vị nào tại Việt Nam sản xuất kháng thể này. Do vậy, để chủ động công nghệ và nguồn sinh phẩm, chúng tôi đã nghiên cứu để tạo ra tế bào lai sản xuất kháng thể kháng nguyên A bằng công nghệ tế bào lai. Trong bài báo này, chúng tôi công bố việc tạo thành công dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu mang kháng nguyên A. Tế bào lai được tạo ra bằng cách lai tế bào lymphocyte B chuột (chuột Balb/c đã được gây miễn dịch bằng hồng cầu mẫu nhóm máu A) với tế bào myeloma chuột sp2/0 với sự có mặt của polyethylene glycol (PEG). Tế bào lai được nuôi cấy trong môi trường chọn lọc hypoxanthine aminopterine thymine (HAT) ở 37oC và 5% CO2. Kết quả là mười hai dòng tế bào lai đơn dòng sinh kháng thể gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu nhóm máu A được chọn lọc từ 1440 vị trí nuôi cấy. Dòng tế bào A6G11C9 được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hiệu giá kháng thể của dòng tế bào này là 512, cường độ phản ứng tốt (+++), thời gian kháng thể gây ngưng kết hồng cầu khoảng 10 giây. Kháng thể do tế bào A6G11C9 sản xuất có thể sử dụng để tạo bộ sinh phẩm xác định nhóm máu ABO