Protective Effects of Betaine against Paraquat-Induced Oxidative Lung Injury in Rats

학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :약학대학 약학과,2019. 8. 이병훈.Betaine 은 수용성 물질로서 간질환에 대한 전통적인 치료약물로 사용되었다. 실험적으로도 여러 독성물질로 유발시킨 간손상 모델에서 보호효과를 확인하였으나 간 이외의 장기에서는 연구된 바가 거의 없다. 그 이유는 betaine 을 대사하는 betaine homocysteine methyl transferase (BHMT) 가 간 이외의 장기에서는 발현되지 않거나 활성이 간에 비하여 현저히 낮기 때문이다. 본 연구에서는 렛트에 paraquat 을 투여하여 발생한 산화적 스트레스로 유도된 폐섬유화 모델에서 betaine 의 보호효과를 확인하였다. Paraquat 를 투여하기 2주 전부터 betaine 을 음용수에 1 % 의 농도로 희석하여 투여하였다. Paraquat 는 0.3 mg/500 μl/kg 의 농도로 기관지를 통하여 폐에 직접 주입하였다. 몸무게 대비 폐무게의 비율은 염증진행구간(4일)에서부터 paraquat 에 의해 증가하였다. 섬유화진행구간(14일)에서 섬유화 지표인 4-hydroxyproline 과 TGF-β1 은 paraquat 에 의한 증가가 betaine 투여에 의해 유의적으로 감소하였고, 조직 염색을 통해서 확인한 섬유화 병변도 완화되었다. 염증지표인 serum TNF-α, tissue TNF-α, serum IL-1β를 측정한 결과, 염증진행구간(4일)에서 paraquat 에 의한 tissue TNF-α 의 증가가 betaine 에 의해 감소하였다. 염증진행구간(4일)과 섬유화진행구간(14일)에서 comet assay 을 통하여 paraquat 에 의한 림프구의 DNA 손상이 관찰되었으며, HO-1, 그리고 iNOS 의 발현 증가를 통하여 산화적 손상이 증가함을 확인하였다. 또한 TOSC assay를 통하여 hydroxyl radical, peroxyl radical 과 peroxyl nitrite 대한 제거능 역시 paraquat 에 의해 유의적인 감소를 확인하였다. 이러한 산화적 스트래스 증가는 모두 betaine 투여에 의하여 완화되었다. 이와 같은 보호효과에 대한 원인을 알아보기 위하여 황함유 아미노산 대사과정을 조사하였다. 섬유화진행구간(14일)에서 betaine 투여에 의한 methionine 의 증가가 확인되었고, methionine adenosyl -transferase II (MATII) 의 발현은 paraquat 와 betaine 의 투여에 의해 급격한 증가를 보였다. S-adenosylmethionine (SAM) 은 betaine 투여에 의해 유의적으로 증가하였고, SAM 의 영향을 받는 polyamine 역시 paraquat 에 의한 감소가 betaine 에 의해 유의적으로 증가하였다. SAH 는 변화가 없었으나 homocysteine 은 paraquat 와 betaine 병용투여군 에서 유의적인 증가를 보였다. Paraquat 투여에 의한 cysteine dioxygenase (CDO) 와 glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC) 의 감소와 함께 cysteine 은 증가하였고, betaine 투여에 의한 GCLC 의 증가는 cysteine 을 감소시키고 환원된 GSH 을 증가시켰다. 한편, 염증진행구간(4일)에서는 paraquat 투여에 의해 SAM, polyamine, SAH, homocysteine, 그리고 cysteine 이 paraquat 에 의해 유의적인 증가를 보였지만, betaine 투여에 의한 변화는 보이지 않았다. 이러한 결과는 paraquat 투여에 의해 황함유 아미노산을 통한 보호기전을 보여줬고, betaine 이 간 이외의 장기인 폐에서도 이러한 보호기전 조절을 통해 폐손상에 대하여 약리학적 효과를 갖는다고 보고 있다.Betaine is a methyl donor used in remethylation of homocysteine to methionine in a metabolic reaction catalyzed by betaine-homocysteine methyltransferase in the liver. However, our recent study suggests that the metabolism of sulfur-containing amino acids in extrahepatic organs may also be influenced by betaine, probably via an increase in methionine uptake from blood. In this study we investigated the effect of betaine against paraquat (PQ)-induced pulmonary injury. Male rats received betaine from 2 wk prior to an intratracheal instillation of PQ (0.3 mg/500 μl/kg). In 2 wk after PQ instillation, there were severe inflammatory and fibrotic lesions accompanied with accumulation of 4-hydroxyproline in the lung, which were prevented effectively by betaine supplementation. Betaine intake also suppressed PQ-induced expression of HO-1 and iNOS in lung, oxidative DNA damage in lymphocytes, and elevation of TGF-β1 in serum. PQ instillation increased cysteine, but decreased glutathione levels, however, betaine supplementation inhibited cysteine accumulation and increased glutathione synthesis. Putrescine, spermidine, and spermine levels were decreased by PQ instillation, but elevated significantly in the rats supplemented with betaine. The present results suggest that betaine may prevent oxidative lung injury by modulating the metabolism of sulfur-containing amino acids despite the lack of betaine-homocysteine methyltransferase in the lung.국문 초록 1 목 차 3 List of Figures and Tables 7 List of Abbreviations 11 서 론 13 1. 폐섬유화 14 1.1. Paraquat 16 2. 황함유 아미노산 대사 19 3. Betaine 23 3.1. 생리작용 26 3.2. 대사 28 4. Glutathione 29 4.1. Glutathione 의 기능 30 4.2. Glutathione 의 합성 31 5. Polyamine 33 5.1. Polyamine 의 대사 34 실험재료 및 방법 38 1. 실험재료 38 1.1. 시약 및 화학물질 38 1.2. 항체 39 2. 동물실험모델 40 3. 혈액 및 조직의 분획 분리 41 3.1. 혈장 및 혈청의 분리 41 3.2. 폐의 실험 검체 준비 41 4. 폐손상 관련지표 측정 42 4.1. 4-hydroxyproline 의 함량 측정 42 4.2. Proinflammatory cytokine 의 함량 측정 43 4.2.1. Serum cytokine (IL-1β, TNF-α, TGF-β 1) 의 함량 측정 43 4.2.2. Tissue TNF-α 의 함량 측정 43 4.3. 림프구의 산화적 DNA 손상 측정 44 4.3.1. 림프구 분리 44 4.3.2. Comet Assay 44 4.4. Total Oxyradical Scavenging Capacity (TOSC) assay 45 4.5. Histopathological examination 46 5. 황함유 아미노산과 관련 대사체의 측정 47 5.1. GSH 및 GSSG 측정 47 5.2. Cysteine 함량 측정 47 5.3. SAM 및 SAH 함량 측정 48 5.4. Methionine, hypotaurine, taurine, ornithine 함량 측정 48 5.5. Homocysteine 함량 측정 49 5.6. Polyamines 함량 측정 50 6. 단백질 발현 측정 51 결 과 53 Part I. 랫트의 폐에서 시간대별 paraquat 의 영향 53 1. Paraquat 투여로 유발된 폐의 무게 변화 54 2. Paraquat 투여로 유발시킨 폐 병변 및 섬유화 변화 58 3. Paraquat 투여로 유발된 산화적 스트래스 변화 61 4. Paraquat 투여에 의해 유발된 폐의 황함유 아미노산과 관련 물질 농도 변화 63 5. Paraquat 에 의해 유발된 황함유 아미노산 대사를 매개하는 효소 변화 66 Part II. Paraquat 으로 유발시킨 폐손상에 대한 betaine 의 효과 68 1. Paraquat 투여 4 일 후, 유도된 몸무게와 폐무게 변화에 대 한 betaine 의 효과 69 2. Paraquat 투여 2 주 후, 유도된 몸무게와 폐무게 변화에 대 한 betaine 의 효과 73 3. Paraquat 투여 4 일 후, 유발된 병변 및 섬유화에 대한 betaine 의 영향 77 4. Paraquat 투여 2 주 후, 유발된 병변 및 섬유화에 대한 betaine 의 영향 82 5. Paraquat 투여 4 일 후, 유발된 염증반응에 대한 betaine 의 영향 88 6. Paraquat 투여 2 주 후, 유발된 염증반응에 대한 betaine 의 영향 92 7. Paraquat 투여 4 일 후, 유발된 산화적 스트래스에 대한 betaine 의 영향 96 8. Paraquat 투여 2 주 후, 유발된 산화적 스트래스에 대한 betaine 의 영향 100 9. Paraquat 투여 4 일 후, 유발된 황함유 아미노산과 관련 물 질 농도 변화에 대한 betaine 의 영향 104 10. Paraquat 투여 2 주 후, 유발된 황함유 아미노산과 관련 물 질 농도 변화에 대한 betaine 의 영향 107 11. Paraquat 투여 4 일 후, 유발된 황함유 아미노산 대사를 매 개하는 효소 변화에 대한 betaine 의 영향 110 12. Paraquat 투여 2 주 후, 유발된 황함유 아미노산 대사를 매 개하는 효소 변화에 대한 betaine 의 영향 112 고 찰 114 결 론 131 참고 문헌 133 Abstract 164Docto

The Influence of some inherited factors on pulmonary fibrosis

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