Einfluss von eosinophilen Granulozyten und durch eosinophile Granulozyten-generierte Lipidoxidationsprodukte auf die Hämostase

Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Das Blutgerinnungssystem stellt eine überlebenswichtige Funktion zum Erhalt der Integrität des Organismus zur Verfügung. Sowohl insuffiziente als auch überschießende Koagulationfähigkeit können zu lebensbedrohlichen Erkrankung führen. Eine intakte Blutgerinnung verhindert einerseits übermäßigen Blutaustritt bei Verletzungen des Gefäßsystems, andererseits Thrombenbildung und damit lebensgefährliche Gefäßverschlüsse und Embolien. An der Hämostase sind eine Vielzahl von Mechanismen, plasmatischen Faktoren sowie zellulären Bestandteilen beteiligt. Obwohl das Gerinnungssystem häufiger Gegenstand der Forschung ist sind bis heute nicht alle beteiligten Zelltypen und Mechanismen identifiziert. Bei Forschungen an 12/15 Lipoxygenase-defizienten Mäusen unserer Arbeitsgruppe zeigte sich eine erhöhte Blutungsneigung gegenüber ihren Wildtyp Altersgenossen. Ziel unserer Forschungsarbeit war daher das Gerinnungsdefizit zu validieren und den Einfluss der 12/15 Lipoxygenase auf das Gerinnungssystem, welche bis dato nicht in Zusammenhang mit der Hämostase gebracht wurde, darzustellen. Methoden Hierfür wurde ein in vivo Blutungstestverfahren etabliert sowie Messreihen mit 12/15 Lipoxygenase-defizienten Mäusen und C57BL/6 Kontrollen durchgeführt. Hierzu wurden sowohl die Zellzahlen der Thrombozyten verglichen als auch Thrombozytenaggregations- und Thrombingenerierungstests durchgeführt. Mittels Durchflusszytometrie und Real Time PCR sowie Western-Blot Analyse wurde die Expression der 12/15 Lipoxygenase im peripheren Blut sowie an in vitro generierten eosinophilen Granulozyten dargestellt. Zuletzt wurden ∆dblGATA1 Mäuse, die durch die Abwesenheit von eosinophilen Granulozyten gekennzeichnet sind, auf einen Blutungsphänotyp hin untersucht. Ergebnisse und Beobachtungen Wir konnten eine signifikant verlängerte Blutungszeit bzw. gestörte Hämostase bei 12/15 Lipoxygenase-defizienten Mäusen gegenüber Wildtyp Mäusen nachweisen. Diese ist aufgrund des fehlenden Unterschiedes in Thrombozytenzahl und Thrombozytenfunktion nicht auf die Population der Thrombozyten zurückzuführen. Ein mangelnder Unterschied bei der Thrombingenerierung lässt einen Defekt im Bereich der zellulär vermittelten Hämostase schlussfolgern. Als Ursprung der 12/15 Lipoxygenase Expression im peripheren Blut konnte eine Untergruppe der Granulozyten, die eosinophilen Granulozyten, identifiziert werden. Schließlich konnte auch im Maus-Modell mit Eosinophilen-defizienten Mäusen der beobachtete Hämostasedefekt nachgewiesen werden. Schlussfolgerungen Wir konnten zeigen dass eosinophile Granulozyten eine bisher unbekannte Rolle im Bereich der Hämostase besitzen und durch ihre Bereitstellung der 12/15 Lipoxygenase-Aktivität zur Hämostase beitragen und dieser Mechanismus somit einen möglicherweise neuen Ansatzpunkt zur Regulation von Hämostase und damit von thrombotischen Erkrankungen bieten kann.Abstract Background and goals The coagulation system provides vital function to maintain integrity of the organism. Both insufficient and excessive coagulability can lead to life threatening illnesses. Intact haemostasis on the one hand prevents excessive blood leakage in case of vascular injuries, on the other hand thrombus formation and thus life threatening vascular occlusion and embolism. Hemostasis involves a variety of mechanisms, plasmatic factors and cellular components. Although the coagulation system has often been subject of studies, the mechanisms involved cell types are still not completely identified. In our studies with 12/15 lipoxygenase deficient mice we recognized a higher bleeding rate between them and their wildtype littermates. We therefore wanted to validate the hemostatic deficit and the influence of 12/15 lipoxygenase on blood coagulation, which until now has not been expected to play a part in hemostasis. Methods Therefore we performed an in vivo bleeding-assay with C57BL/6 and 12/15 lipoxygenase deficient mice. We analysed the number of platelets and performed platelet aggregation-assays and thrombin-generation assays. We used flow cytometry as well as real time PCR and western-blotting to show the expression of 12/15 lipoxygenase in peripheral blood and on in vitro generated eosinophils. At last we used the previously described ∆dblGATA1 mouse-model, which shows a complete absence of the eosinophilic lineage in consequence of a targeted mutation to prove the coagulatory phenotype Results We could show a significant bleeding-phenotype between 12/15 lipoxygenase deficient and wildtype mice. Because of the missing difference in number or function of platelets as well as intrinsic defects measured by thrombin generation, our findings pointed towards a defect in the cellular based hemostasis. As an origin of 12/15 lipoxygenase in peripheral blood we could identify a subpopulation of ganulocytes, the eosinophils. At the end we confirmed the bleeding-phenotype even in ∆dblGATA1 eosinophil deficient mice. Conclusion We could show that eosinophils do have a yet unexpected role in coagulation and because they provide a 12/15 lipoxygenase activity they could be a new target for regulation of hemostasis and therefor thrombotic desease

Enzymatic lipid oxidation by eosinophils propagates coagulation, hemostasis, and thrombotic disease

Blood coagulation is essential for physiological hemostasis, but simultaneously contributes to thrombotic disease. However, molecular and cellular events controlling initiation and propagation of coagulation are still incompletely understood. Here we demonstrate an unexpected role of eosinophils during plasmatic coagulation, hemostasis and thrombosis. Using a large-scale epidemiological approach, we identified eosinophil cationic protein (ECP) as independent and predictive risk factor for thrombotic events in humans. Concurrent experiments showed that eosinophils contributed to intravascular thrombosis by exhibiting a strong endogenous thrombin-generation capacity, which relied on the enzymatic generation and active provision of a pro-coagulant phospholipid-surface enriched in 12/15-lipoxygenase (12/15-LO)-derived hydroxyeicosatetraenoic acid-phosphatidylethanolamines. Our findings reveal a previously unrecognized role of eosinophils and enzymatic lipid oxidation as regulatory elements that facilitate both hemostasis and thrombosis in response to vascular injury, thus identifying promising new targets for the treatment of thrombotic disease