STUDI SPERIMENTALI SUL MECCANISMO DELLA DISTROFIA DA MUTAZIONE A CARICO DEI GENI CODIFICANTI PER IL COLLAGENE VI

Mutations of genes coding for collagen VI are responsible, in humans, of congenital muscular dystrophies, giving rise to three syndromes Bethlem Myopathy (BM), Ullrich Congenital Muscular Dystrophy (UCMD) and Congenital Myosclerosis (CM). Based on the high degree of heterogeneity and the overlap between them, it has been proposed that these disorders may represent a clinical continuum rather than strictly separated entities, and that there may be a wider spectrum of collagen VI related disorders. Despite these major advances in understanding their genetic bases, the molecular pathogenesis remained partially obscure. As it is the case for many genetic diseases, creation of animal models may be the key to understand the physiopathology, and to devise and test potential therapies. Several years ago (Bonaldo at al, 1998) a mutant mouse with targeted inactivation of COL6A1 gene, coding for the 1(VI) chain, was created. In the absence of a 1(VI) chain, collagen VI does not assemble and is not secreted in the extracellular matrix, and therefore homozygous null mice (Col6a1-/-) completely lack collagen VI in their tissues. These mice are affected by early onset myopathic disease with weakness and histological alterations of skeletal muscles. Col6a1-/- muscle have loss of contractile strength with ultrastructural alterations of sarcoplasmic reticulum (SR) and mitochondria and spontaneous apoptosis. There is a latent mitochondrial dysfunction in myofibers which can be revealed upon incubation with the selective F1F0-ATPase inhibitor oligomycin, which causes mitochondrial depolarization, Ca2+ deregulation and increased apoptosis. These defects were reversible, as they can be normalized by plating Col6a1-/- myofibers on collagen VI or by addition of cyclosporin A (CsA), the inhibitor of mitochondrial permeability transition pore (PTP). Collagen VI myopathies, in mice and humans, can be effectively treated with drugs acting downstream on pathogenic lesion. These observations lead to the hypothesis that the lack of collagen VI causes an increased probability of opening of the PTP, but we don’t know through which signalling pathway the lack of collagen VI in the extracellular matrix can have effects on mitochondria. One important partner of collagen VI is the proteoglycan NG2. In particular, there is evidence that NG2 binds to collagen VI via a protein-protein interaction (Tillet et al, 1997). NG2 may be considered an important receptor mediating collagen VI-sarcolemma interactions and this relationship may be disrupted in the pathogenesis of Bethlem and Ullrich dystrophies. We also know that the perturbation of NG2 distribution on the cell surface results in parallel change in collagen VI distribution (Nishiyama et al,1997). The NG2-collagen VI interaction may be important for organization of the extracellular matrix, for binding of cells to the matrix, for determination of cell morphology in relation to the matrix, and for a transduction of transmembrane signalling. To clarify the relevance of NG2 for muscle function and structure, muscles of mice carrying a null mutation of NG2 were studied. The aim of this study was a comparative characterization (in vivo, ex vivo and in vitro) of the phenotype of muscles from ColVI-/- and NG2-/- mice and the evaluation of the differences between the two models to understand in what way the absence of these proteins might lead to mitochondrial damage. The experimental program was aimed to the characterization of muscles from C57BL/6, Col6a1-/- and NG2-/- mice in vivo, ex vivo ed in vitro. The integrity of the membrane was tested with the blue Evans dye which allows to detect, pointed out with blue color, muscle fibers in which the sarcolemma has been damaged. At first the analysis of functional parameters of muscle contraction was carried out in vivo, with the following tests: - mouse force (Grip test) - force developed by the muscle gastrocnemius during isometric contraction. Then the analysis of functional parameters was developed ex vivo: - intact muscle diaphragm, EDL, soleus dissected and analysed in myograph - electrophoresis of proteins from diaphragm, EDL, soleus - histological and histochemical analysis of gastrocnemius and tibial. Finally, single muscle fibres were kept in culture and studied, in vitro: - recording Ca2+ transient in single fibres of FDB - electrophoresis of single fibres - immunocytochemistry analyses. The results of all the above listed tests have shown that the two phenotypes have only a partial overlap and, thus, NG2 does not represent the only structural/functional connection between Collagen VI in the ECM and the intracellular processes in muscle fibres. The role of integrin require to be explored.Le mutazioni dei geni che codificano per le subunità del collagene VI sono una delle cause delle patologie muscolari ereditarie umane che si manifestano come la Miopatia di Bethlem (BM), la Distrofia Muscolare Congenita di Ullrich (UCMD) e la Miosclerosi Congenita (CM). Basandosi sull’alto grado di eterogeneità e di parziale sovrapposizione tra di loro, è stato proposto che questi disordini possano rappresentare un “continuum” clinico piuttosto che entità strettamente separate, e che ci possa essere un più ampio spettro di disordini connessi al collagene VI. Nonostante i grandi progressi nella comprensione delle loro basi genetiche, la patogenesi molecolare rimane ancora in parte sconosciuta. Come nel caso di molti difetti genetici, la creazione di animali transgenici può essere la chiave per comprendere la fisiopatologia e per mettere a punto, e testare, potenziali terapie. Molti anni fa (Bonaldo et al, 1998) è stato creato un topo mutante con inattivazione mirata del gene COL6A1, che codifica per la catena 1(VI). In assenza della catena 1(VI), il collagene non è assemblato e non è secreto nella matrice extracellulare, e pertanto il topo omozigote mutante (Col6a1-/-) perde il collagene VI nei suoi tessuti. I topi sono affetti da un disordine miopatico ad esordio precoce con debolezza e cambiamenti istologici del muscolo scheletrico. I muscoli del Col6a1-/- perdono forza contrattile e mostrano alterazioni ultrastrutturali a livello del reticolo sarcoplasmatico (SR), dei mitocondri e apoptosi spontanea. E’ presente una disfunzione mitocondriale latente nelle miofibre che si può evidenziare con incubazione con oligomicina, inibitore della F1F0-ATPasi, che causa depolarizzazione mitocondriale, de-regolazione del Ca2+ e aumento dell’apoptosi. Questi difetti sono reversibili, e possono essere normalizzati piastrando le fibre muscolari di Col6a1-/- su collagene VI o somministrando cisclosporina A (CsA), un inibitore del poro di transizione di permeabilità mitocondriale (PTP). Le miopatie dovute al collagene VI, sia umane che negli animali, possono essere efficacemente trattate con tale farmaco che agisce a valle della lesione patogenetica (Irwin et al, 2003 e Merlini et al, 2008). Così queste osservazioni portano ad ipotizzare che la mancanza del collagene VI causa un aumento dell’apertura del PTP ma non è ancora noto per mezzo di quale via di segnale. Un importante partner del collagene VI è il proteoglicano NG2. In particolare, ci sono prove che NG2 si leghi al collagene VI attraverso un interazione proteina-proteina (Tillet et al, 1997). NG2 può essere considerato un importante mediatore dell’interazione collagene VI-sarcolemma e il venir meno di questa relazione potrebbe avere un ruolo nella patogenesi delle distrofie di Bethlem e Ullrich. Sappiamo inoltre che modificazioni nella distribuzione superficiale di NG2 porta ad un parallelo cambiamento nella distribuzione del collagene VI (Nishiyama et al,1997). L’interazione NG2-collagene VI può essere importante nell’organizzazione della matrice, per il legame delle cellule alla matrice, per determinare la morfologia cellulare in risposta alla matrice, e per la trasduzione del segnale transmembrana. Per chiarire l’importanza di NG2 per la funzione e la struttura muscolare, sono stati studiati muscoli di topi con mutazione di NG2. Lo scopo dello studio è la caratterizzazione fenotipica comparativa (in vivo, ex vivo and in vitro) di Col6a1-/- and NG2-/- e la valutazione delle differenze tra i due modelli per comprendere se la mancanza di queste proteine porti ad un simile danno nella fibra muscolare. Si è proceduto dapprima a saggiare l’integrità della membrana con il colorante vitale blue Evans che permette di rilevare, evidenziandole con colorazione blu, le fibre muscolari il cui sarcolemma ha subito un danno. Poi, si è passati quindi all’analisi dei parametri funzionali della contrazione muscolare in vivo quali: - sviluppo di forza (Grip test) - sviluppo della forza massimale del gastrocnemio stimolato per via nervosa. Successivamente è stata effettuata una valutazione ex vivo: - meccanica dei muscoli interi diaframma, EDL e soleo - elettroforesi delle proteine muscolari - analisi istochimiche di gastrocnemio e tibiale. Infine per avere un quadro completo si è continuata l’ indagine in vitro : - transienti di calcio su singole fibre di FDB - elettroforesi su singole fibre di FDB - analisi immunocitochimiche. I risultati di tali analisi hanno mostrato che i due fenotipi hanno solamente una parziale sovrapposizione e quindi NG2 non rappresenta l’unica via di mediazione della presenza del collagene VI. Il ruolo delle integrine richiede di essere esplorato