Biosynthesis of the Labyrinthopeptines A1, A2 and A3, a new class of lantibiotics from Actinomadura namibiensis

Grundlage für die vorliegende Arbeit war der 1988 als Actinomadura namibiensis taxonomisch eingeordnete Mikroorganismus, der die drei peptidischen Sekundärmetabolite A1, A2 und A3 produziert. Die Struktur von A2 konnte mit Hilfe einer Röntgenkristall-strukturanalyse aufgeklärt werden, was die Einordnung in die Klasse der ribosomal synthetisierten Lantibiotika ermöglichte. Die im Folgenden als Labyrinthopeptin A2 bezeichnete Verbindung weist neben den typischerweise in Lantibiotika vorkommenden Lanthioninbrücken sowie einer Disulfidbrücke eine strukturelle Besonderheit auf, die bisher nicht literaturbekannt ist und als Labionin bezeichnet wurde. Dabei handelt es sich um eine Verbrückung, die zu quartär substituierten C-Atomen führt und somit eine ungewöhnliche C-C-Bindungsknüpfung während der Biosynthese erfordert. In der vorliegenden Arbeit sollten diese Vorkenntnisse genutzt werden, um die Biosynthese von Labyrinthopeptin A2 (LabA2) und dabei insbesondere der Labionin-Verbrückung aufzuklären. Um dieses Ziel zu erreichen, sollte zunächst das entsprechende Biosynthese-Gencluster gesucht werden. Nachdem Bedingungen optimiert werden konnten, die die Isolierung hochmolekularer genomischer DNA aus A. namibiensis ermöglichten, wurde in Zusammenarbeit mit der Firma Agowa GmbH, Berlin, eine Cosmidbank erstellt. Die größte Herausforderung bestand nun darin, ausgehend von der 18 Aminosäuren lange Struktur von LabA2, von der nur zwölf als proteinogene Aminosäuren definiert waren, eine Sonde für ein Screening der Cosmidbank abzuleiten. Durch Kombination verschiedener PCR-Methoden gelang es schließlich, eine Sonde zu generieren, die im Cosmidbankscreening eingesetzt werden konnte. Nach der Sequenzierung eines positiv-getesteten Cosmids konnte mit Hilfe von verschiedenen Softwaretools das Biosynthese-Gencluster identifiziert und annotiert werden. Darin konnte u.a. ein Strukturgen identifiziert werden, das für die Präpropeptide der Labyrinthopeptine A1 und A3 kodiert. Basierend auf der hohen Homologie der Labyrinthopeptine untereinander konnte damit ein Strukturvorschlag für LabA1 und LabA3 erstellt werden. Die weitere Auswertung des Biosynthese-Genclusters zeigte neben den Strukturgenen noch zwei Gene für einen ABC-Transporter sowie ein Gen, das C-terminal eine Ser/Thr-Kinase- und N-terminal eine LanC-Domäne kodiert. Dabei handelt es sich vermutlich um das für die Labionin-Biosynthese zuständige Gen. Um diese Hypothese experimentell zu beweisen, wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Die erste Strategie sah einen in vitro-Assay mit dem entsprechenden überexprimierten Protein und hypothetischen Substraten vor, während die zweite Strategie die heterologe Expression des gefundenen Biosynthese-Genclusters in S. lividans umfasste. In beiden Strategien konnten bedeutende Zwischenziele erreicht werden, die in zukünftigen Arbeiten die Bestätigung der Hypothese ermöglichen sollten.The strain Actinomadura namibiensis produces the three secondary metabolites of peptidic origin, labyrintopeptine A1, A2 and A3. The X-ray structure analysis of A2 classified it as a lantibiotic with five intramolecular rings. Beside one disulfid bridge and two lanthionin rings, a hitherto unknown posttranslational modification was found in the structure and designated as labionin ring. The aim of this work was to investigate the biosynthesis of labyrinthopeptine A2 by searching and analyzing the biosynthetic gene cluster. Furthermore, the structures of the labyrinthopeptines A1 and A3 were elucidated