Insights into nuclear organization in plants as revealed by the dynamic distribution of Arabidopsis SR splicing factors

Serine/arginine-rich (SR) proteins are splicing regulators that share a modular structure consisting of one or two N-terminal RNA recognition motif domains and a C-terminal RS-rich domain. We investigated the dynamic localization of the Arabidopsis thaliana SR protein RSZp22, which, as we showed previously, distributes in predominant speckle-like structures and in the nucleolus. To determine the role of RSZp22 diverse domains in its nucleolar distribution, we investigated the subnuclear localization of domain-deleted mutant proteins. Our results suggest that the nucleolar localization of RSZp22 does not depend on a single targeting signal but likely involves different domains/motifs. Photobleaching experiments demonstrated the unrestricted dynamics of RSZp22 between nuclear compartments. Selective inhibitor experiments of ongoing cellular phosphorylation influenced the rates of exchange of RSZp22 between the different nuclear territories, indicating that SR protein mobility is dependent on the phosphorylation state of the cell. Furthermore, based on a leptomycin B- and fluorescence loss in photobleaching-based sensitive assay, we suggest that RSZp22 is a nucleocytoplasmic shuttling protein. Finally, with electron microscopy, we confirmed that RSp31, a plant-specific SR protein, is dynamically distributed in nucleolar cap-like structures upon phosphorylation inhibition. Our findings emphasize the high mobility of Arabidopsis SR splicing factors and provide insights into the dynamic relationships between the different nuclear compartments

Functional cellular study and dynamics of Arabidopsis thaliana SR splicing factors

Les travaux présentés dans cette thèse de doctorat portent sur l’étude de la distribution cellulaire dynamique des facteurs essentiels d’épissage de la famille SR d’Arabidopsis thaliana. Le processus d’excision/épissage du pré-mRNA consiste en la reconnaissance précise des introns au niveau des sites d’épissage, en leur excision et en la ligature des exons. Les facteurs d'épissage SR possèdent un domaine particulier riche en dipeptides sérines et arginines répétés et également un ou deux domaines hautement conservés de liaison au RNA. Ils sont impliqués dans la reconnaissance et le choix des sites d’épissage ainsi que dans l’assemblage du spliceosome. Au cours de cette thèse de doctorat, nous avons montré la distribution subcellulaire dynamique des protéines SR d'Arabidopsis (RSp31, RSZp22, RSp34 et RSZ33) fusionnée à la GFP, et ce dans divers systèmes expérimentaux (cellules foliaires de tabac et d’Arabidopsis, cellules BY-2). Celles-ci se localisent au sein du noyau et se concentrent en certains sites nucléaires précis dénommés speckles. Nous avons aussi observé que l’une d’entre-elles, RSZp22, peut se localiser au sein du nucléole suivant les conditions cellulaires, ce qui suggérait un rôle possible de cette protéine dans le transport du mRNA. Nous avons étudié le rôle des différents domaines structuraux des protéines SR dans leur distribution cellulaire en réalisant des délétions partielles des protéines RSp31 et RSZp22 et en analysant la localisation des protéines mutantes. Par co-expression de différents couples de protéines SR fusionnées à deux variantes de protéines fluorescentes (la GFP et la mRFP1 ou monomeric Red Fluorescent Protein 1), nous avons également montré une co-localisation générale des protéines SR végétales, à l’exception de RSZp22 qui est la seule à présenter cette localisation nucléolaire. Nous avons aussi analysé la redistribution des protéines SR après traitement par divers inhibiteurs de la phosphorylation et déphosphorylation et également de la transcription. Aussi, l'utilisation de diverses méthodes de microscopie confocale (comme le FRAP ou Fluorescence Recovery After Photobleaching ou encore le FLIP ou Fluorescence Loss In Photobleaching) nous a permis de montrer que les protéines SR d’Arabidopsis sont hautement dynamiques au sein du noyau. Enfin, nous avons observé grâce à la technique du FLIP que RSZp22 est capable de faire la navette entre le noyau et le cytoplasme et que ce transport nucléo-cytoplasmique dépend de la voie d’exportation via le récepteur CRM1/exportine1 [1-3].1.Docquier, S., et al., Nuclear bodies and compartmentalization of pre-mRNA splicing factors in higher plants. Chromosoma, 2004. 112(5): p. 255-66.2.Tillemans, V., et al., Functional distribution and dynamics of Arabidopsis SR splicing factors in living plant cells. Plant J, 2005. 41(4): p. 567-82.3.Tillemans, V., et al., Insights into Nuclear Organization in Plants as Revealed by the Dynamic Distribution of Arabidopsis SR Splicing Factors. Plant Cell, 2006. 18(11): p. 3218-34

Nuclear bodies and compartmentalization of pre-mRNA splicing factors in higher plants

We studied the fine structural organization of nuclear bodies in the root meristem during germination of maize and Arabidopsis thaliana using electron microscopy (EM). Cajal bodies (CBs) were observed in quiescent embryos as well as germinating cells in both species. The number and distribution of CBs were investigated. To characterize the nuclear splicing domains, immunofluorescence labelling with antibodies against splicing factors (U2B" and m3G-snRNAs) and in situ hybridisation (with U1/U6 antisense probes) were performed combined with confocal microscopy. Antibodies specific to the Arabidopsis SR splicing factor atRSp31 were produced. AtRSp31 was detected in quiescent nuclei and in germinating cells. This study revealed an unexpected nuclear speckled organization of atRSp31 in root epidermal cells where micro clusters of interchromatin granules were also observed by EM. Therefore, we examined the distribution of green fluorescent protein (GFP)-tagged atRSp31 in living cells after Agrobacterium-mediated transient expression. When expressed transiently, atRSp31-GFP exhibited a speckled distribution in leaf cells. Treatments with -amanitin, okadaic acid, staurosporine or heat-shock induced the speckles to reorganize. Furthermore, we have generated stable Arabidopsis transgenics expressing atRSp31-GFP. The distribution of the fusion protein was identical to the endogenous atRSp31. Three-dimensional time-lapse confocal microscopy showed that speckles were highly dynamic domains over time