Efeito de polietilenoglicol e polivinilpirrolidona na extração e hibridização de rRNA bacteriano de células expostas a taninos

In order to detect fluctuations in ruminal microbial populations due to forage tannins using 16S ribosomal RNA (rRNA) probes, recovery of intact rRNA is required. The objective of this work was to evaluate the effect of polyethylene glycol (PEG) and polyvinylpirrolidone (PVP) on extraction of bacterial rRNA, in the presence of tannins from tropical legume forages and other sources, that hybridize with oligonucleotide probes. Ruminococcus albus 8 cells were exposed to 8 g/L tannic acid or 1 g/L condensed tannins extracted from Acacia angustissima, banana (Musa sp.) skin, Desmodium ovalifolium, red grape (Vitis vinifera) skin and Inga edulis, or no tannins. Cells were rinsed with Tris buffer pH 7 containing either 8% PEG or 6% PVP prior to cell lysis. Total RNA samples rinsed with either PEG or PVP migrated through denaturing agarose gels. The 16S rRNA bands successfully hybridized with a R. albus species-specific oligonucleotide probe, regardless of tannin source. The effect of rinsing buffers on the density of 16S rRNA bands, as well as on the hybridization signals was compared. There were significant effects (P < 0.01) when the controls were compared to either buffer treatments due to tannin type, buffer used and the interaction of tannin type and buffer. The significant interaction indicates the influence of tannin type on the parameters evaluated.A recuperação de RNA ribossômico (rRNA) intacto é necessária para a detecção de flutuações na população microbiana ruminal decorrentes dos taninos de forrageiras, utilizando-se sondas para 16S rRNA. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de polietilenoglicol (PEG) e polivinilpirrolidona (PVP) na extração de rRNA bacteriano, em presença de taninos de leguminosas forrageiras tropicais e de outras fontes, que possa ser hibridizado com sondas de oligonucleotídeos. Culturas de Ruminococcus albus 8 foram expostas ou não a 8 g/L de ácido tânico ou a 1 g/L de taninos condensados, extraídos de Acacia angustissima, casca de banana (Musa sp.), Desmodium ovalifolium, cascas de uvas vermelhas (Vitis vinifera) e Inga edulis. As culturas foram lavadas com tampão Tris pH 7 contendo 8% PEG ou 6% PVP antes do rompimento das células. Amostras de RNA total lavadas com PEG ou PVP migraram em géis de agarose. Bandas de 16S rRNA hibridizaram com uma sonda de oligonucleotídeos espécie-específica para R. albus, independentemente da fonte de tanino. Comparou-se o efeito dos tampões de lavagem sobre a densidade das bandas de 16S rRNA, assim como sobre a intensidade de hibridização. Ocorreram efeitos significativos para fontes de taninos, tampões e para a interação entre taninos e tampões (P < 0.01). A interação significativa indica a influência do tipo de tanino nos parâmetros avaliados

Polyethylene glycol and polyvinylpirrolidone effect on bacterial rRNA extraction and hybridization from cells exposed to tannins Efeito de polietilenoglicol e polivinilpirrolidona na extração e hibridização de rRNA bacteriano de células expostas a taninos

In order to detect fluctuations in ruminal microbial populations due to forage tannins using 16S ribosomal RNA (rRNA) probes, recovery of intact rRNA is required. The objective of this work was to evaluate the effect of polyethylene glycol (PEG) and polyvinylpirrolidone (PVP) on extraction of bacterial rRNA, in the presence of tannins from tropical legume forages and other sources, that hybridize with oligonucleotide probes. Ruminococcus albus 8 cells were exposed to 8 g/L tannic acid or 1 g/L condensed tannins extracted from Acacia angustissima, banana (Musa sp.) skin, Desmodium ovalifolium, red grape (Vitis vinifera) skin and Inga edulis, or no tannins. Cells were rinsed with Tris buffer pH 7 containing either 8% PEG or 6% PVP prior to cell lysis. Total RNA samples rinsed with either PEG or PVP migrated through denaturing agarose gels. The 16S rRNA bands successfully hybridized with a R. albus species-specific oligonucleotide probe, regardless of tannin source. The effect of rinsing buffers on the density of 16S rRNA bands, as well as on the hybridization signals was compared. There were significant effects (P<0.01) when the controls were compared to either buffer treatments due to tannin type, buffer used and the interaction of tannin type and buffer. The significant interaction indicates the influence of tannin type on the parameters evaluated.<br>A recuperação de RNA ribossômico (rRNA) intacto é necessária para a detecção de flutuações na população microbiana ruminal decorrentes dos taninos de forrageiras, utilizando-se sondas para 16S rRNA. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de polietilenoglicol (PEG) e polivinilpirrolidona (PVP) na extração de rRNA bacteriano, em presença de taninos de leguminosas forrageiras tropicais e de outras fontes, que possa ser hibridizado com sondas de oligonucleotídeos. Culturas de Ruminococcus albus 8 foram expostas ou não a 8 g/L de ácido tânico ou a 1 g/L de taninos condensados, extraídos de Acacia angustissima, casca de banana (Musa sp.), Desmodium ovalifolium, cascas de uvas vermelhas (Vitis vinifera) e Inga edulis. As culturas foram lavadas com tampão Tris pH 7 contendo 8% PEG ou 6% PVP antes do rompimento das células. Amostras de RNA total lavadas com PEG ou PVP migraram em géis de agarose. Bandas de 16S rRNA hibridizaram com uma sonda de oligonucleotídeos espécieespecífica para R. albus, independentemente da fonte de tanino. Comparou-se o efeito dos tampões de lavagem sobre a densidade das bandas de 16S rRNA, assim como sobre a intensidade de hibridização. Ocorreram efeitos significativos para fontes de taninos, tampões e para a interação entre taninos e tampões (P<0.01). A interação significativa indica a influência do tipo de tanino nos parâmetros avaliados