BRET and Time-resolved FRET strategy to study GPCR oligomerization: from cell lines toward native tissues

The concept of oligomerization of G protein-coupled receptor (GPCR) opens new perspectives regarding physiological function regulation. The capacity of one GPCR to modify its binding and coupling properties by interacting with a second one can be at the origin of regulations unsuspected two decades ago. Although the concept is interesting, its validation at a physiological level is challenging and probably explains why receptor oligomerization is still controversial. Demonstrating direct interactions between two proteins is not trivial since few techniques present a spatial resolution allowing this precision. Resonance energy transfer (RET) strategies are actually the most convenient ones. During the last two decades, bioluminescent resonance energy transfer and time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) have been widely used since they exhibit high signal-to-noise ratio. Most of the experiments based on GPCR labeling have been performed in cell lines and it has been shown that all GPCRs have the propensity to form homo- or hetero-oligomers. However, whether these data can be extrapolated to GPCRs expressed in native tissues and explain receptor functioning in real life, remains an open question. Native tissues impose different constraints since GPCR sequences cannot be modified. Recently, a fluorescent ligand-based GPCR labeling strategy combined to a TR-FRET approach has been successfully used to prove the existence of GPCR oligomerization in native tissues. Although the RET-based strategies are generally quite simple to implement, precautions have to be taken before concluding to the absence or the existence of specific interactions between receptors. For example, one should exclude the possibility of collision of receptors diffusing throughout the membrane leading to a specific FRET signal. The advantages and the limits of different approaches will be reviewed and the consequent perspectives discussed

Fluorescent ligands to investigate GPCR binding properties and oligomerization

Abstract Fluorescent ligands for GPCRs (G-protein-coupled receptors) have been synthesized for a long time but their use was usually restricted to receptor localization in the cell by fluorescent imaging microscopy. During the last two decades, the emergence of new fluorescence-based strategies and the concomitant development of fluorescent measurement apparatus have dramatically widened the use of fluorescent ligands. Among the various strategies, TR (time-resolved)-FRET (fluorescence resonance energy transfer) approaches exhibit an interesting potential to study GPCR interactions with various partners. We have derived various sets of ligands that target different GPCRs with fluorophores, which are compatible with TR-FRET strategies. Fluorescent ligands labelled either with a fluorescent donor (such as europium or terbium cryptate) or with a fluorescent acceptor (such as fluorescein, dy647 or Alexa Fluor ® 647), for example, kept high affinities for their cognate receptors. These ligands turn out to be interesting tools to develop FRET-based binding assays. We also used these fluorescent ligands to analyse GPCR oligomerization by measuring FRET between ligands bound to receptor dimers. In contrast with FRET strategies, on the basis of receptor labelling, the ligand-based approach we developed is fully compatible with the study of wild-type receptors and therefore with receptors expressed in native tissues. Therefore, by using fluorescent analogues of oxytocin, we demonstrated the existence of oxytocin receptor dimers in the mammary gland of lactating rats

Les canaux calciques des cellules glomerulees de la surrenale de rat: mise en evidence et caracterisation par la technique du patch-clamp

SIGLEAvailable from INIST (FR), Document Supply Service, under shelf-number : T 78977 / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Les canaux calciques des cellules glomerulees de la glande surrenale de rat : mise en evidence et caracterisation par la technique du "patch-clamp"

La sécrétion d'aldostérone et de corticostérone par les cellules glomérulées de surrénale de rat est dépendante de la concentration de calcium extracellulaire. Dans le but d'identifier les structures impliquées dans cette dépendance vis-à-vis du calcium et plus particulièrement dans l'influx de calcium résultant d'une stimulation des cellules glomérulées, nous avons réalisé une caractérisation des canaux calciques. Trois types de courants calciques sensibles au potentiel ont été identifiés ; un courant transitoire "bas-seuil" et deux composantes "haut-seuil", l'une étant transitoire, l'autre soutenue. Leurs propriétés sont très similaires à celles des canaux calciques des neurones de poulet ; nous avons par conséquent adopté la même nomenclature et nous les avons nommés T, N et L. Trois courants calciques de fond, que nous avons nommés B1, B2 et B3 ont également été mis en évidence. La probabilité d'ouverture des canaux B1 est maximale à un potentiel de -70 mV et diminue pour des potentiels supérieurs ou inférieurs. Nous n'avons pas pu déterminer la sensibilité au voltage des composantes B2 et B3. Aucun de ces trois canaux de fond n'est sensible aux dihydropyridines. Nous avons par la suite étudié le contrôle excercé par l'adrénocorticotropine, le principal sécrétagogue des cellules glomérulées de rat, sur l'activité des canaux T et L. L'adrénocorticotropine inhibe le courant T selon un processus biphasique et augmente l'amplitude de la composante L. L'analyse des effets de l'adrénocorticotropine sur les potentiels d'action confirme les résultats obtenus lors des études réalisées sur les courants calciques

Les canaux calciques des cellules glomerulees de la glande surrenale de rat : mise en evidence et caracterisation par la technique du "patch-clamp"

La sécrétion d'aldostérone et de corticostérone par les cellules glomérulées de surrénale de rat est dépendante de la concentration de calcium extracellulaire. Dans le but d'identifier les structures impliquées dans cette dépendance vis-à-vis du calcium et plus particulièrement dans l'influx de calcium résultant d'une stimulation des cellules glomérulées, nous avons réalisé une caractérisation des canaux calciques. Trois types de courants calciques sensibles au potentiel ont été identifiés ; un courant transitoire "bas-seuil" et deux composantes "haut-seuil", l'une étant transitoire, l'autre soutenue. Leurs propriétés sont très similaires à celles des canaux calciques des neurones de poulet ; nous avons par conséquent adopté la même nomenclature et nous les avons nommés T, N et L. Trois courants calciques de fond, que nous avons nommés B1, B2 et B3 ont également été mis en évidence. La probabilité d'ouverture des canaux B1 est maximale à un potentiel de -70 mV et diminue pour des potentiels supérieurs ou inférieurs. Nous n'avons pas pu déterminer la sensibilité au voltage des composantes B2 et B3. Aucun de ces trois canaux de fond n'est sensible aux dihydropyridines. Nous avons par la suite étudié le contrôle excercé par l'adrénocorticotropine, le principal sécrétagogue des cellules glomérulées de rat, sur l'activité des canaux T et L. L'adrénocorticotropine inhibe le courant T selon un processus biphasique et augmente l'amplitude de la composante L. L'analyse des effets de l'adrénocorticotropine sur les potentiels d'action confirme les résultats obtenus lors des études réalisées sur les courants calciques

Oligomérisation des récepteurs couplés au protéines G de la famille de la vasopressine et de l'ocytocine (mise en évidence dans les tissus natifs)

Les récepteurs couplés aux protéines G forment une grande famille de récepteurs transmembranaires. De nombreuses études montrent que ces récepteurs présenteraient une tendance à interagir entre eux et à former des oligomères. Ces structures sont toutefois sujettes à controverse. En effet, très peu d'éléments permettent d'affirmer que ces oligomères existeraient dans les tissus natifs, la plupart des caractérisations se faisant en systèmes hétérologues. Nous avons donc développé une approche basée d'une part sur l'utilisation de ligands fluorescents pour marquer les récepteurs dans leur environnement natif et d'autre part sur le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) en temps résolu en utilisant des cryptates de lanthanides, en particulier le Lumi4-Tb. Nous avons ainsi pu montrer et publier l'existence d'oligomères du récepteur de l'ocytocine dans la glande mammaire. Le protocole de cette étude a aussi été publié et a été validé pour la mise en évidence d'hétéro-oligomères, plus précisément entre les récepteurs V1a et V2 de la vasopressine. La poursuite de l'étude de ce phénomène dans les tissus natifs nous a poussés à développer notre propre dispositif de microscopie FRET en temps résolu. Ce dispositif est basé sur un microscope en champ large auquel nous avons ajouté une source laser pour l'excitation pulsée et une caméra CCD Multigate pour la détection. Nous en présentons ici les premiers résultats ainsi que sa validation pour l'utilisation de multiples fluorophores accepteurs avec une contamination minimale par le Lumi4-Tb. Enfin, nous proposons un modèle pharmacologique montrant l'utilisation de ligands bivalents pour étudier le couplage des oligomères.G-protein coupled receptors form a very large family of transmembrane receptors. Numerous studies have shown that these receptors showed a tendency to interact and form oligomers. These structures are however the matter of great debate. Indeed, very few elements allow us to maintain that these oligomers could exist in native tissues, most studies being carried out in heterologous systems. We have therefore developed an approach based for one part on the use of fluorescent ligands to label receptors in their native environment, and on the other part on time-resolved FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) by using lanthanide cryptates, more specifically Lumi4-Tb. We have thus been able to show and publish the existence of oxytocin receptor oligomers in the mammary gland. The protocol used for this study was also published and validated for the study of hetero-oligomers, more specifically between vasopressin V1a and V2 receptors. Following on our study of oligomers in native tissues, we have developed our own setup to perform time-resolved FRET microscopy. This setup is based on a wide field microscope to which we added a laser source for the pulsed excitation and a Multigate CCD camera for imaging. We are here presenting the first results as well as its validation for the use of multiple acceptor fluorophores with minimal bleed through from the Lumi4-Tb. Lastly, we propose a pharmacological model showing the use of bivalent ligands to study oligomer coupling.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Fluorescent agonists and antagonists for vasopressin/oxytocin g protein-coupled receptors: usefulness in ligand screening assays and receptor studies.

International audienc

Comparison of vasopressin and oxytocin receptors in the rat uterus and vascular tissue

International audienc

Original Fluorescent Ligand-Based Assays Open New Perspectives in G-Protein Coupled Receptor Drug Screening

The identification of new drugs exhibiting reduced adverse side-effects constitutes a great challenge for the next decade. Various steps are needed to screen for good ligand candidates and one of them is the evaluation of their binding properties. New strategies based on fluorescence measurement constitute excellent alternatives to the traditional radioactive assays. Less hazardous, faster and cheaper, these methods also exhibit very good sensitivity and can be used on various biological models such as heterologous expression systems or native tissues