Circular and L50-like leaderless enterocins share a common ABC-transporter immunity gene

Microbes live within complex communities of interacting populations, either free-living in waters and soils or symbionts of animals and plants. Their interactions include the production of antimicrobial peptides (bacteriocins) to antagonize competitors, and these producers must carry their own immunity gene for self-protection. Whether other coexisting populations are sensitive or resistant to the bacteriocin producer will be key for the population dynamics within the microbial community. The immunity gene frequently consists of an ABC transporter to repel its own bacteriocin but rarely protects against a nonrelated bacteriocin. A case where this cross-resistance occurs mediated by a shared ABC transporter has been shown between enterocins MR10A/B and AS-48. The first is an L50-like leaderless enterocin, while AS-48 is a circular enterocin. In addition, L50-like enterocins such as MR10A/B have been found in E. faecalis and E. faecium, but AS-48 appears only in E. faecalis. Thus, using the ABC transporter of the enterocin MR10A/B gene cluster of Enterococcus faecalis MRR10-3 as a cross-resistance model, we aimed to unravel to what extent a particular ABC transporter can be shared across multiple bacteriocinogenic bacterial populations. To this end, we screened the MR10A/B-ABC transporters in available microbial genomes and analyzed their sequence homologies and distribution. Overall, our main findings are as follows: (i) the MR10A/B-ABC transporter is associated with multiple enterocin gene clusters; (ii) the different enterocins associated with this transporter have a saposin-like fold in common; (iii) the Mr10E component of the transporter is more conserved within its associated enterocin, while the Mr10FGH components are more conserved within the carrying species. This is the least known component of the transporter, but it has shown the greatest specificity to its corresponding enterocin. Bacteriocins are now being investigated as an alternative to antibiotics; hence, the wider or narrower distribution of the particular immunity gene should be taken into account for clinical applications to avoid the selection of resistant strains. Further research will be needed to investigate the mechanistic interactions between the Mr10E transporter component and the bacteriocin as well as the specific ecological and evolutionary mechanisms involved in the spread of the immunity transporter across multiple bacteriocins.Junta de Andalucía A-BIO-083-UGR18, BIO 309Ministerio de Ciencia e Innovación PEJ2018-003019-

Article Lactiplantibacillus paraplantarum BPF2 and Pediococcus acidilactici ST6, Two Bacteriocinogenic Isolated Strains from Andalusian Spontaneous Fermented Sausages

Traditional spontaneously fermented foods are well known for their sensory and safety properties, which is mainly due to their indigenous microflora. Within this group of food, Mediterranean dry-cured sausages stand out as a significant source of lactic-acid bacterial strains (LAB) with biotechnological properties, such as their antimicrobial activity. The aim of this study was to investigate the biodiversity of antagonistic LAB strains from different Andalusian traditional sausages, such as salchichón and chorizo. First, a screening was carried out focusing on the antimicrobial activity against foodborne pathogens, such as Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Clostridium perfringens, and Staphylococcus aureus, selecting two strains due to their higher antibiosis properties, both in agar and liquid media. These bacteria were identified as Lactiplantibacillus paraplantarum BPF2 and Pediococcus acidilactici ST6. In addition, genomic studies confirmed the presence of certain structural genes related to the production of bacteriocins. Finally, the culture supernatants of both strains were purified and analyzed by LC-MS/MS, obtaining the relative molecular mass and the amino acid sequence and identifying the peptides as the bacteriocins Pediocin-PA and Leucocin K. In conclusion, genomes and antimicrobial substances of P. acidilactici ST6, a Pediocin-PA producer, and Lpb. paraplantarum BPF2, a Leucocin K producer, isolated from Andalusian salchichón and chorizo, respectively, are presented in this work. Although further studies are required, these strains could be used alone or in combination as starters or protective cultures for the food industryPRIMA program, under BioProMedFood project (Reference Number: 2019-SECTION2-4; CUP: J34I19004820005)PRIMA program is supported by the European Union H2020 program and innovation progra

Alternativa al uso de antibióticos en animales de granja y acuicultura

Introducción. El desarrollo de sistemas intensivos en producción animal tanto en ganadería como en acuicultura ha dado lugar a una serie de problemas asociados como las distintas zoonosis que amenazan al sector o el incremento de las resistencias bacterianas como consecuencia del abuso de antibióticos terapéuticos y promotores del crecimiento. El aumento de la resistencia a antibióticos tanto de bacterias comensales como patógenas ha llevado a que en los últimos años las autoridades sanitarias hayan restringido el uso de dichos antibióticos en producción animal. Esto ha llevado a investigadores y productores a la búsqueda de alternativas sostenibles como el empleo de probióticos y extractos vegetales con actividad antimicrobiana.Objetivos. El objetivo de esta línea de investigación es evaluar la influencia sobre la microbiota intestinal y los parámetros productivos de animales de granja de piensos suplementados con una cepa potencialmente probiótica de E. faecalis (UGRA10) (Cebrian et al., 2012) y de diferentes preparaciones de un extracto de aliáceas (DOMCA, España).Resultados. La suplementación en la dieta de gallinas ponedoras con el enterococo o con el extracto de aliáceas produjo un incremento significativo de la producción de huevos y cambios en la comunidad bacteria de íleon y ciego. Resultados similares se observaron en lechones recién destetados, en doradas y en lubinas, en cuyas dietas se suministró el extracto de aliáceas. En estos tres grupos de animales, el grupo al que se le suministró el extracto experimentaron una mejora significativa en varios parámetros productivos, asociados estos a cambios en la comunidad bacteriana de íleon y ciego con respecto a animales con dietas basales. En el caso de los lechones, el efecto del extracto fue en general similar al que experimentaron lechones a los que se les suministró colistina, un antibiótico frecuentemente usado en ganadería. Ciertos grupos bacterianos considerados tradicionalmente beneficiosos experimentaron incrementos significativos en sus abundancias relativas, mientras que otros potencialmente patógenos disminuyeron.Conclusiones. Estos resultados sugieren que la administración de ciertos microorganismos potencialmente probióticos como E. faecalis UGRA10 o extractos vegetales como el extracto de aliáceas son capaces de modificar la composición de la microbiota intestinal de gallinas ponedoras, cerdos, doradas y lubinas. Estos cambios en la microbiota están asociados a mejoras en la productividad de estos animales. Estudios futuros serían necesarios para profundizar en este tema, sobre todo aquellos relacionados con mejoras en el estado sanitario general de los animales, como el sistema inmune

Bases biológicas de los patrones de producción y resistencia de peptidos antimicrobianos (bacteriocinas)

Los microorganismos conforman la mayor parte de los seres vivos del planeta. Estos se pueden encontrar en prácticamente cualquier ambiente formando comunidades microbianas complejas esenciales para la salud humana, ambiental y en múltiples áreas biotecnológicas. Sin embargo, a pesar del gran impacto para la humanidad nuestro conocimiento de los principios que gobiernan la estructuración y funcionamiento de los ecosistemas microbianos es muy limitada, lo que implica una escasa capacidad para un control y optimización racional de las comunidades microbianas. En estas comunidades se producen multitud de interacciones esenciales en la estructuración, mantenimiento y desarrollo de las mismas, siendo el antagonismo clave en la configuración del equilibrio entre las poblaciones. Múltiples sustancias antimicrobianas están involucradas en el antagonismo, destacando los péptidos antimicrobianos producidos por bacterias (bacteriocinas), como uno de los compuestos antagónicos más comunes en las especies microbianas. Su producción implica la expresión coordinada de varios grupos de genes distribuidos en uno o más operones, pudiendo estar ubicados tanto en el cromosoma como en plásmidos. En la producción de estas sustancias antibióticas es esencial que los productores porten su propio gen de inmunidad para evitar la autoinhibición. Sabemos que la producción de bacteriocinas está ampliamente distribuida entre las especies bacterianas, sin embargo, esto contrasta con la alta diversidad de comunidades de microorganismos a las que pertenecen, lo que parece contradecir el efecto letal de las bacteriocinas. Su estudio se ha limitado a un punto de vista local en la interacción bilateral entre cepas productora y sensible, dejando de lado que suelen vivir en ambientes de diferente grado de complejidad microbiológica. Además, los estudios de inmunidad se centran en los patrones de resistencia en la propia inmunidad del organismo productor, pero con poca frecuencia indagan en los patrones de resistencia de otros individuos que puedan coexistir con los productores. Por ello, el objetivo general de la presente tesis ha sido discernir los mecanismos moleculares y ecológicos que explican los patrones de producción y resistencia de péptidos antimicrobianos (bacteriocinas) en comunidades de bacterias lácticas. Para ello se comenzó estudiando las bases moleculares de la producción y resistencia a bacteriocinas de distintas estirpes mediante ensayos de inmunidad cruzada entre cepas productoras de las bacteriocinas AS-48, en concreto Enterococcus faecalis A- 48-32, y diversos mutantes de la misma; y cepas productoras de MR10A/B como Enterococcus faecalis MRR10-3. Estos ensayos mostraron que la resistencia cruzada por parte de las cepas productoras de AS-48 a la enterocina MR10A/B se debe a la presencia de un transportador ABC (Transportador-2 en el cluster de AS-48). Dicho transportador aparece tanto en el cluster de genes de AS-48 como de MR10-3, siendo el responsable de la inmunidad en cada caso. Pare estos análisis, describimos la composición del cluster génico de MR10A/B, que aún no estaba descrito. Estos hallazgos abren el camino a la investigación de la resistencia más allá de las variantes de una misma bacteriocina. La constatación de este mecanismo compartido de inmunidad condujo a estudiar la variabilidad de dichos genes de inmunidad (Transportador-2) y su distribución en otras especies. En concreto este transportador se encontró en múltiples poblaciones de enterococos y asociado con diferentes bacteriocinas más allá de AS-48 o variantes de MR10A/B, así como huérfano en bacteriocinas. Teniendo en cuenta este último caso, la resistencia a la bacteriocina podría movilizarse independientemente de su bacteriocina asociada, lo que podría generar diversas poblaciones que compartan un sistema de resistencia común. Esta característica es crucial para desarrollar modelos más precisos de dinámica de producción/resistencia en la naturaleza. Adicionalmente, durante estos estudios pusimos de manifiesto el papel clave de Mr10E en el grado de inmunidad/resistencia, componente del que se desconoce su función. Al estudiar la especificidad de cada componente del transportador se mostró que la secuencia primaria de Mr10E cambia en función de la bacteriocina de su cluster correspondiente, mientras que el resto de componentes cambian en función de la especie en la que se localizan, independientemente de la bacteriocina a la que se asocie. Dada la posibilidad de aparición de diversos grupos de poblaciones con un sistema de resistencia común, se realizó un estudio de genómica comparativa utilizando las cepas de E. faecalis S-48, E. faecalis UGRA10 y E. faecalis MRR10-3 como bacterias modelo para los productores de enterocina AS-48 y L50. Mediante la secuenciación de dichos genomas y el análisis genómico comparativo con los genomas de E. faecalis disponibles públicamente, pusimos de manifiesto poca cohesión entre estos productores; sin embargo, algunas enterocinas podrían impulsar la expansión clonal de poblaciones específicas. Para finalizar, se ha estudiado el efecto de la producción de bacteriocinas a nivel de poblaciones y comunidades de bacterias lácticas. Para ello se utilizó la microbiota de quesos como sistema modelo; y más concretamente el género Enterococcus como bacteria bacteriocinogénica modelo debido a su frecuente producción de enterocinas y presencia en niveles variables en estas comunidades. Mediante la caracterización y cuantificación de las poblaciones de enterococos y comunidades de bacterias lácticas, así como gracias a la detección y cuantificación de las capacidades enterocinogénicas de las poblaciones de enterococos, se ha puesto de manifiesto una tendencia general de mayor diversidad en las comunidades de bacterias lácticas asociadas a los productores de enterocina. Sin embargo, la mayor diversidad se encuentra relacionada negativamente con los productores de enterocinas, de forma que, a niveles bajos o moderados de productores de enterocinas mayor diversidad de bacterias lácticas se alcanzan en la comunidad del queso. En qué medida estos resultados pueden extenderse a otras especies de LAB o incluso a otros ecosistemas microbianos silvestres necesitará más investigación. De todos modos, nuestro estudio apunta a la producción de bacteriocinas como un factor importante a tener en cuenta para controlar las comunidades bacterianas. Por tanto, los resultados obtenidos en la presente tesis suponen un avance en el conocimiento de los patrones que gobiernan las comunidades microbianas, poniendo de manifiesto la importancia de las interacciones antagonistas mediadas por bacteriocinas en la estructuración y comprensión de las dinámicas poblacionales y comunitarias de microorganismos. Futuros estudios en otro tipo de comunidades lácticas o comunidades naturales más complejas permitirán obtener un conocimiento exhaustivo de cómo las poblaciones de una comunidad se organizan ante unas condiciones abióticas dadas, permitiendo así la predicción, el diseño y la explotación racional de las comunidades microbianas.Tesis Univ. Granada

Enterocin Cross-Resistance Mediated by ABC Transport Systems

In their struggle for life, bacteria frequently produce antagonistic substances against competitors. Antimicrobial peptides produced by bacteria (known as bacteriocins) are active against other bacteria, but harmless to their producer due to an associated immunity gene that prevents self-inhibition. However, knowledge of cross-resistance between different types of bacteriocin producer remains very limited. The immune function of certain bacteriocins produced by the Enterococcus genus (known as enterocins) is mediated by an ABC transporter. This is the case for enterocin AS-48, a gene cluster that includes two ABC transporter-like systems (Transporter-1 and 2) and an immunity protein. Transporter-2 in this cluster shows a high similarity to the ABC transporter-like system in MR10A and MR10B enterocin gene clusters. The aim of our study was to determine the possible role of this ABC transporter in cross-resistance between these two different types of enterocin. To this end, we designed different mutants (Tn5 derivative and deletion mutants) of the as-48 gene cluster in Enterococcus faecalis and cloned them into the pAM401 shuttle vector. Antimicrobial activity assays showed that enterocin AS-48 Transporter-2 is responsible for cross-resistance between AS-48 and MR10A/B enterocin producers and allowed identification of the MR10A/B immunity gene system. These findings open the way to the investigation of resistance beyond homologous bacteriocins

Allium Extract Implements Weaned Piglet’s Productive Parameters by Modulating Distal Gut Microbiota

Antimicrobial resistance (AMR) has risen as a global threat for human health. One of the leading factors for this emergence has been the massive use of antibiotics growth-promoter (AGPs) in livestock, enhancing the spread of AMR among human pathogenic bacteria. Thus, several alternatives such as probiotics, prebiotics, or phytobiotics have been proposed for using in animal feeding to maintain or improve productive levels while diminishing the negative effects of AGPs. Reducing the use of antibiotics is a key aspect in the pig rearing for production reasons, as well as for the production of high-quality pork, acceptable to consumers. Here we analyze the potential use of Allium extract as an alternative. In this study, weaned piglets were fed with Allium extract supplementation and compared with control and antibiotic (colistin and zinc oxide) treated piglets. The effects of Allium extract were tested by analyzing the gut microbiome and measuring different productive parameters. Alpha diversity indices decreased significantly in Allium extract group in caecum and colon. Regarding beta diversity, significant differences between treatments appeared only in caecum and colon. Allium extract and antibiotic piglets showed better values of body weight (BW), average daily weight gain (ADG), and feed conversion ratio (FCR) than control group. These results indicate that productive parameters can be implemented by modifying the gut microbiota through phytobiotics such as Allium extract, which will drive to drop the use of antibiotics in piglet die

Enterocin Cross-Resistance Mediated by ABC Transport Systems

In their struggle for life, bacteria frequently produce antagonistic substances against competitors. Antimicrobial peptides produced by bacteria (known as bacteriocins) are active against other bacteria, but harmless to their producer due to an associated immunity gene that prevents selfinhibition. However, knowledge of cross-resistance between different types of bacteriocin producer remains very limited. The immune function of certain bacteriocins produced by the Enterococcus genus (known as enterocins) is mediated by an ABC transporter. This is the case for enterocin AS-48, a gene cluster that includes two ABC transporter-like systems (Transporter-1 and 2) and an immunity protein. Transporter-2 in this cluster shows a high similarity to the ABC transporter-like system in MR10A and MR10B enterocin gene clusters. The aim of our study was to determine the possible role of this ABC transporter in cross-resistance between these two different types of enterocin. To this end, we designed different mutants (Tn5 derivative and deletion mutants) of the as-48 gene cluster in Enterococcus faecalis and cloned them into the pAM401 shuttle vector. Antimicrobial activity assays showed that enterocin AS-48 Transporter-2 is responsible for cross-resistance between AS-48 and MR10A/B enterocin producers and allowed identification of the MR10A/B immunity gene system. These findings open the way to the investigation of resistance beyond homologous bacteriocins.Junta de Andalucía (Programa Operativo FEDER Andalucía 2014–2020), grant number A-BIO-083-UGR18Plan Estatal de Garantía Juvenil (Fondo Social Europeo, Gobierno de España, Ref. PEJ2018-003019-A

Enterocin Cross-Resistance Mediated by ABC Transport Systems

In their struggle for life, bacteria frequently produce antagonistic substances against competitors. Antimicrobial peptides produced by bacteria (known as bacteriocins) are active against other bacteria, but harmless to their producer due to an associated immunity gene that prevents self-inhibition. However, knowledge of cross-resistance between different types of bacteriocin producer remains very limited. The immune function of certain bacteriocins produced by the Enterococcus genus (known as enterocins) is mediated by an ABC transporter. This is the case for enterocin AS-48, a gene cluster that includes two ABC transporter-like systems (Transporter-1 and 2) and an immunity protein. Transporter-2 in this cluster shows a high similarity to the ABC transporter-like system in MR10A and MR10B enterocin gene clusters. The aim of our study was to determine the possible role of this ABC transporter in cross-resistance between these two different types of enterocin. To this end, we designed different mutants (Tn5 derivative and deletion mutants) of the as-48 gene cluster in Enterococcus faecalis and cloned them into the pAM401 shuttle vector. Antimicrobial activity assays showed that enterocin AS-48 Transporter-2 is responsible for cross-resistance between AS-48 and MR10A/B enterocin producers and allowed identification of the MR10A/B immunity gene system. These findings open the way to the investigation of resistance beyond homologous bacteriocins.This research was funded by Junta de Andalucía (Programa Operativo FEDER Andalucía 2014–2020), grant number A-BIO-083-UGR18. C.T.-P. was funded by Plan Estatal de Garantía Juvenil (Fondo Social Europeo, Gobierno de España, Ref. PEJ2018-003019-A).Ye

<i>Allium</i> Extract Implements Weaned Piglet’s Productive Parameters by Modulating Distal Gut Microbiota

Antimicrobial resistance (AMR) has risen as a global threat for human health. One of the leading factors for this emergence has been the massive use of antibiotics growth-promoter (AGPs) in livestock, enhancing the spread of AMR among human pathogenic bacteria. Thus, several alternatives such as probiotics, prebiotics, or phytobiotics have been proposed for using in animal feeding to maintain or improve productive levels while diminishing the negative effects of AGPs. Reducing the use of antibiotics is a key aspect in the pig rearing for production reasons, as well as for the production of high-quality pork, acceptable to consumers. Here we analyze the potential use of Allium extract as an alternative. In this study, weaned piglets were fed with Allium extract supplementation and compared with control and antibiotic (colistin and zinc oxide) treated piglets. The effects of Allium extract were tested by analyzing the gut microbiome and measuring different productive parameters. Alpha diversity indices decreased significantly in Allium extract group in caecum and colon. Regarding beta diversity, significant differences between treatments appeared only in caecum and colon. Allium extract and antibiotic piglets showed better values of body weight (BW), average daily weight gain (ADG), and feed conversion ratio (FCR) than control group. These results indicate that productive parameters can be implemented by modifying the gut microbiota through phytobiotics such as Allium extract, which will drive to drop the use of antibiotics in piglet diet