The impact of absorbed photons on antimicrobial photodynamic efficacy

Due to increasing resistance of pathogens towards standard antimicrobial procedures, alternative approaches that are capable of inactivating pathogens are necessary in support of regular modalities. In this instance, the photodynamic inactivation of bacteria (PIB) may be a promising alternative. For clinical application of PIB it is essential to ensure appropriate comparison of given photosensitizer (PS)-light source systems, which is complicated by distinct absorption and emission characteristics of given PS and their corresponding light sources, respectively. Consequently, in the present study two strategies for adjustment of irradiation parameters are evaluated: (i) matching energy doses applied by respective light sources (common practice) and (ii) by development and application of a formula for adjusting the numbers of photons absorbed by PS upon irradiation by their corresponding light sources. Since according to the photodynamic principle one PS molecule is excited by the absorption of one photon, this formula allows comparison of photodynamic efficacy of distinct PS per excited molecule. In light of this, the antimicrobial photodynamic efficacy of recently developed PS SAPYR was compared to that of clinical standard PS Methylene Blue (MB) regarding inactivation of monospecies biofilms formed by Enterococcus faecalis and Actinomyces naeslundii whereby evaluating both adjustment strategies. PIB with SAPYR exhibited CFU-reductions of 5.1 log10 and 6.5 log10 against E. faecalis and A. naeslundii, respectively, which is declared as a disinfectant efficacy. In contrast, the effect of PIB with MB was smaller when the applied energy dose was adjusted compared to SAPYR (CFU-reductions of 3.4 log10 and 4.2 log10 against E. faecalis and A. naeslundii), or there was even no effect at all when the number of absorbed photons was adjusted compared to SAPYR. Since adjusting the numbers of absorbed photons is the more precise and adequate method from a photophysical point .

Etablierung eines in-vitro Biofilmmodelles aus drei dentalen Bakterienstämmen

Monoinfektionen treten in der freien Natur so gut wie nie auf, daher liefert die Verwendung von planktonisch kultivierten Bakterien zur Testung antimikrobieller Substanzen zwar zufriedenstellende Ergebnisse, diese können jedoch nicht mit klinischen Ergebnissen korrelieren [168,236]. Mikroorganismen haben verglichen zu planktonisch lebenden Bakterien eine gesteigerte Resistenz gegen äußere Einflüsse, wie Austrocknung, Scherkräfte, antibakterielle Substanzen und Phagozytose [53,71,83]. Um einen therapeutischen Erfolg bei der Eliminierung der dreidimensionalen Biofilmstruktur in-vivo zu erreichen, muss die Wirkung antiseptischer Agenzien auch auf Biofilme in-vitro untersucht werden. Hierfür ist die Etablierung eines in-vitro Biofilmmodelles die Voraussetzung, da antimikrobielle Substanzen auf planktonisch kultivierte Bakterien häufig effektiver wirken, als auf adhärent wachsende Bakterien [51]. Die Etablierung eines in-vitro Biofilmmodelles erfolte mit drei, in verschiedenen Phasen der Biofilmbildung vorkommenden Bakterienstämmen, Actinomyces naeslundi, Fusobacterium nucleatum und Enterococcus faecalis. Für die Herstellung einer adhärenten Bakterienkultur wurden 96 Well-Mikrotiterplatten (tissue culture treated) verwendet. Die Biofilmbildung wurde anhand zwei unterschiedlicher Medien untersucht, dem BHI-Medium und einem künstlichen Speichelmedium nach Pratten et.al. [180], dem 1g/l Saccharose zugefügt wurden und das mit Stichstoff desoxygeniert wurde. Nach einer 30minütigen Vorbehandlung der Mikrotiterplatten mit dem jeweiligen Kultivierungsmedium wurden jeweils 80µl der zuvor hergestellten Bakteriensuspensionen in die Wells der Mikrotiterplatten pipettiert. Die Biofilmbildung fand unter statischen, anaerobischen Bedingungen statt. Anaerobe Verhältnisse wurden mittels einer Genbox (Genbox Jar 7l) und einem Gasgenerator herrgestellt. Es wurde das Wachstumsverhalten zu den Inkubationszeiten 12, 24, 48 und 72 Stunden untersucht. Als Maß für das Wachstum im Biofilm wurde die Veränderung der DNA-Menge der jeweiligen Bakterienstämme über die 16s Gensequenz mit der quantitativen real-time PCR (Light Cycler, Roche) bestimmt (n=12). Mittels LIVE/DEAD-Färbung (Biofilm Viability Kit von Invitrogen) wurde der prozentuale Anteil lebender Bakterien im Biofilm ermittelt (n=10), wobei nicht spezifiziert wurde welche Arten dies waren. Ein essentieller Nachweis eines Biofilmes mit seiner dreidimensionalen Struktur ist die Entstehung einer extrazellulären polymeren Substanz (EPS). Die EPS wurde mit dem Fluoreszenzfarbstoff Concanavalin A (ConA) nachgewiesen. Sowohl die LIVE/DEAD-Färbungen, als auch die ConA-Färbungen wurden durch zusammengesetzten Schichtaufnahmen visualisiert. Die in-vitro Biofilmbildung mit dem BHI-Medium zeigte, im Gegensatz zum künstlichen Speichelmedium, keinerlei Adhäsionsverhalten der Bakterien. Mit Anwendung des künstlichen Speichelmediums sind alle drei untersuchten Bakterienarten adhärent in einem Biofilm signifikant gewachsen und zeigten tendenziell ein, mit der Kulturdauer zunehmendes Wachstum, dargestellt als zunehmende DNA-Konzentration. Die Auswertung von 10 unabhängig gewachsenen Biofilmen ergab, dass nach einer 72-stündigen Kultivierungszeit im Median 49,5% (range: 46% – 53%) der Bakterien im Biofilm lebend waren. Die Fluoreszenzfärbung der extrazellulären polymeren Substanz mit ConA konnte die Matrix in dem in-vitro gewachsenen Biofilm nachweisen und beweist die komplexe dreidimensionale mikrobielle Gemeinschaft. Die in-vitro Biofilmbildung aus drei verschiedenen Bakterienstämmen konnte mit künstlichem Speichel als Kultivierungsmedium erfolgreich nachgewiesen werden

Antimicrobial photodynamic therapy for inactivation of biofilms formed by oral key pathogens

With increasing numbers of antibiotic-resistant pathogens all over the world there is a pressing need for strategies that are capable of inactivating biofilm-state pathogens with less potential of developing resistances in pathogens. Antimicrobial strategies of that kind are especially needed in dentistry in order to avoid the usage of antibiotics for treatment of periodontal, endodontic or mucosal topical infections caused by bacterial or yeast biofilms. One possible option could be the antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), whereby the lethal effect of aPDT is based on the principle that visible light activates a photosensitizer (PS), leading to the formation of reactive oxygen species, e.g. singlet oxygen, which induce phototoxicity immediately during illumination. Many compounds have been described as potential PS for aPDT against bacterial and yeast biofilms so far, but conflicting results have been reported. Therefore, the aim of the present review is to outline the actual state of the art regarding the potential of aPDT for inactivation of biofilms formed in vitro with a main focus on those formed by oral key pathogens and structured regarding the distinct types of PS