Transcytose à travers la barrière hémato-encéphalique (étude in vitro du transport des lipoproteines de basse densité et du peptide ß-amyloïde)

La Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) est une interface localisée au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECs). Elle présente des caractéristiques structurales et métaboliques spécifiques restreignant considérablement les échanges entre le sang et le cerveau dans le but de maintenir l homéostasie du système nerveux central (SNC). La présence de transporteurs et récepteurs au niveau de CECs permet l apport de nutriments essentiels au fonctionnement cérébral. L expression de ces propriétés est induite par l environnement cérébral et notamment par la population astrocytaire. Dans notre laboratoire, la BHE est reconstituée in vitro en co-cultivant des CECs bovines et des cellules gliales primaires de rat reproduisant les principales caractéristiques de la BHE in vivo. Son utilisation a permis de mettre en évidence une voie originale de transcytose (récepteur-dépendante) assurant le transport des lipoprotéines de basse densité (LDL) vers le parenchyme cérébral. Nous avons caractérisé les premières étapes de ce processus et démontré que celles-ci impliquent des structures cellulaires spécialisées comme les cavéoles et les cavéosomes, permettant aux lipoprotéines d être relarguées intactes vers le compartiment cérébral. Récemment, de nombreux travaux ont placé la BHE au centre des échanges des peptides b-amyloïde (Ab) entre le sang et le cerveau. Un défaut des mécanismes de transport est suspecté d être à l origine de l accumulation cérébrale de ces peptides responsables de la maladie d Alzheimer (MA). En utilisant notre modèle in vitro de BHE, nous avons étudié l implication des CECs dans les échanges de ces peptides. Nous avons démontré l implication du récepteur receptor for advanced glycation end-products (RAGE) dans l entrée vers le compartiment cérébral des peptides Ab. Ce transport est spécifique et implique la voie des cavéoles. L implication de pompes d efflux telles que la P-glycoprotéine (P-gp) et la breast cancer resistance protein (BCRP) dans la restriction de l influx des peptides Ab a également été mise en évidence. D autre part, des résultats préliminaires suggèrent que le récepteur low density lipoprotein receptor-related 1 (LRP1) n est pas impliqué dans l efflux des peptides Ab. Ces résultats contribuent à apporter une meilleure compréhension du rôle de la BHE dans la MA et permettent d envisager de nouvelles approches thérapeutiques.The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic interface located at the brain capillary endothelial cells (BCECs) level. This barrier possesses some morphological and enzymatic properties whose aim is to maintain homeostasis of central nervous system (CNS) by firmly reducing the passages between blood and brain. BCECs express carrier-mediated transporters and receptors allowing the income of nutrients that are essential to brain function. These BBB properties come from brain environment and especially from the astrocytic population. In our laboratory, we have developed an in vitro BBB model consisting of a co-culture of bovine BCECs and new-born rat glial cells that closely mimics the in vivo situation. In this in vitro model, an original transcytosis pathway (receptor-dependent) that ensures low density lipoproteins (LDL) transport into the brain parenchyma has been discovered. We have characterized the first steps of this transport and we have shown that involve specialized cellular structures such as caveolae and caveosomes, allowing intact lipoproteins to be released into the brain compartment. Recently, many studies have considered the BBB like a very suitable site for the exchanges of amyloid b (Ab) peptides between blood and brain. An alteration in the mechanisms of transport is suspected to result in cerebral accumulation of these peptides which are responsible for Alzheimer's Disease (AD). Using our in vitro model, we investigated the involvement of the BCECs in the exchanges of these peptides. Our works show an asymmetrical transport across the BBB suggesting the involvement of specific receptors and transporters. We have demonstrated the involvement of receptor for advanced glycation end products (RAGE) in the entry into the brain compartment. This transport is specific and involves the caveolae s pathway. The involvement of P-glycoprotein (P-gp) and breast cancer resistance protein (BCRP) efflux pumps in restricting the influx of Ab peptides was also highlighted. Moreover, preliminary results suggest that low density lipoprotein receptor related-1 (LRP1) is not involved in the efflux of Ab peptides. These studies help to provide a better understanding of the role of the BBB in AD and allow to consider new therapeutic approaches.ARRAS-Bib.electronique (620419901) / SudocSudocFranceF

La barrière hémato-encéphalique et l'ischémie cérébrale (étude in vitro de la dysfonction et de la protection microvasculaire)

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une interface localisée au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux. Elle présente des caractéristiques physiques et métaboliques spécifiques restreignant les échanges entre le sang et le cerveau dans le but de maintenir l homéostasie du système nerveux central. Dans des conditions pathologiques comme l ischémie cérébrale, la perte de son intégrité provoque l apparition d un oedème vasogénique qui aggrave considérablement le pronostic vital des patients. Malheureusement, les mécanismes impliqués dans l hyperperméabilité vasculaire demeurent inconnus, ce qui limite l utilisation de la seule thérapie disponible à 5% des patients. Depuis qu aucun agent pharmacologique n a réussit à être neuroprotecteur, notre compréhension des rapports entre le sang et le cerveau est remise en cause. La complexité des interactions entre la BHE et les cellules nerveuses a mené au concept d une unité fonctionnelle dite neurovasculaire. Ainsi de nouvelles stratégies de protection émergent à partir d observations au niveau vasculaire. Ainsi la première partie de nos travaux a consisté à étudier l effet vasculoprotecteur potentiel du fénofibrate, un hypolipémiant agoniste du récepteur nucléaire PPAR-a (Peroxisome Proliferator- Activated Receptor-alpha), dont le bénéfice est observé en clinique depuis quelques années et plus récemment dans une étude expérimentale menée chez la souris. Les mécanismes de cette protection aujourd hui inconnus, pourraient impliquer la BHE réputée très peu perméable à ce fibrate. Un renforcement de la BHE limiterait la formation de l oedème cérébral. Pour cela nous avons adapté un modèle in vitro syngénique murin de BHE aux études de perméabilité en condition d OGD (oxygen and glucose deprivation) mimant les conséquences immédiates de l occlusion, toute première étape de l accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique. Le modèle consiste en une co-culture de cellules endothéliales primaires de capillaires cérébraux et de cellules gliales primaires. Nos travaux démontrent qu un traitement préventif au fénofibrate protège l endothélium en limitant l hyperperméabilité induite par l OGD. Cette action protectrice cible exclusivement l endothélium et dépend de l activation de PPAR-a démontré par l absence d effet protecteur sur les cellules endothéliales dont le gène codant pour PPAR-a a été invalidé. La seconde partie de l étude s est intéressée aux dommages vasculaires de la reperfusion, étape plus tardive de l ischémie cérébrale connue pour aggraver l oedème vasogénique et mener à des hémorragies fatales. A l aide de notre modèle in vitro, nous avons étudié l effet de la réoxygénation sur la perméabilité vasculaire dans le but de se rapprocher des conditions ischémiques in vivo. Après une incubation en condition d OGD, la co-culture est replacée dans un milieu réoxygéné pendant une période allant de 2h à 24h. La mesure de la perméabilité vasculaire a démontré un profil multiphasique de l ouverture de la BHE dépendant de la présence des cellules gliales. L analyse en microscopie électronique des cellules endothéliales a suggéré une modulation fine de la fonctionnalité des jonctions serrées endothéliales. De plus, l étude en IRM de diffusion chez la souris in vivo a révélé des mouvements d eau qui suggèrent une perturbation de l homéostasie hydrique du parenchyme cérébral au voisinage de l occlusion dans les étapes précoces mais aussi dans les étapes tardives. En conclusion, l ensemble des travaux met en avant la possibilité d une préservation pharmacologique de l intégrité de la BHE au début de l ischémie cérébrale. Celle-ci montre l intérêt des approches in vitro utilisant un modèle cellulaire pertinent et caractérisé. La validation de la cible cellulaire et moléculaire du fénofibrate à l aide de notre modèle ouvre une première voie d exploration des mécanismes impliqués dans ce phénomène de protection microvasculaire précoce. Cependant, la dysfonction retardée de la BHE est également un élément à prendre en compte pour se rapprocher de la physiopathologie de l ischémie in vivo et espérer à terme une amélioration de l approche thérapeutique de cette pathologie.The Blood brain barrier (BBB) is an interface localised at brain capillary endothelial cells. The BBB possesses both physical and metabolic restrictive properties aiming at the maintenance of the central nervous system homeostasis. But under pathological conditions like ischemic stroke, the loss of BBB integrity induces a cerebral vasogenic edema which considerably worsens the vital prognosis of patients. The mechanisms underlying this vascular hyperpermeability are currently unknown thus limiting the use of the only medical intervention available at only 5% of stroke patients. Since no pharmacological molecule succeeded in being neuroprotective, our understanding of the relationships between blood and brain is questioned. The complex interactions between the BBB and nervous cells have lead to the concept of a functional unit, termed the neurovascular unit. Thus, new strategies are recently emerging from observation of vascular events. Thus, the first aim of our study was to test the potential vasculoprotective action of fenofibrate, a hypolipemic drug known as an activator of the nuclear receptor PPAR-a a (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-alpha), as benefit against stroke was observed in clinics since a few years, and recently reported in an experimental study. Yet unknown mechanisms, the protective effect may be exerted on the BBB since reported as impermeable to this compound. An early tightening of the BBB would limit the extent of brain edema. Hence, we have adapted a mouse syngenic BBB in vitro cell model to permeability studies under the stress condition found at the early stage of ischemic stroke defined in vitro as oxygen and glucose deprivation (OGD). This stress simulates the early consequences of occlusion. This model consists of a co-culture of primary brain capillary endothelial cells together with primary glial cells. We have demonstrated that a preventive treatment with fenofibrate has a protective effect on the BBB by limiting the hyperpermeability induced by the OGD condition. This effect targets endothelial cells exclusively and depends on PPAR-a activation, as revealed by the absence of protective action of fenofibrate on PPAR-a deficient endothelial cells. The second part of the study has focused on vascular reperfusion injury, a later stage of ischemia known to worsen vasogenic oedema and to lead to fatal haemorrhage. Using our in vitro BBB model, we have studied the effect of reoxygenation on vascular permeability in order to closely simulate in vivo ischemic condition. Following incubation under OGD condition, the co-cultures were placed into an oxygenated culture medium from 2h to 24h. The BBB permeability demonstrated a multiphasic opening of the BBB which depended on glial cells presence. Electronic microscopy analysis of BBB endothelial cells suggested a fine modulation of tight junction functionality. Moreover, the MRI diffusion analysis in mice has revealed particular water movements suggesting an early disturbance in water homeostasis of brain parenchyma in the vicinity of occlusion. In conclusion, this work put forward the idea of a pharmacological BBB protection at the early stage of ischemic stroke. This demonstrates the relevance of in vitro approaches using a pertinent and well characterised cell model. The validation of cellular and molecular targets of fenofibrate opens a way of first exploration of mechanisms involved in this early microvascular protection phenomenon. But the late BBB dysfunction also needs to be taken into account for a complete fitting with in vivo stroke pathophysiology and an improvement of the therapeutic approaches to this pathology.ARRAS-Bib.electronique (620419901) / SudocSudocFranceF

Transfert cérébral et neuroprotection (Cerebral Transfer and Neuroprotection)

International audienceLes cellules endothéliales de capillaires cérébraux, support anatomique de la barrière hémato-encéphalique, présentent des caractéristiques structurales et métaboliques qui restreignent considérablement les échanges entre le sang et le parenchyme cérébral. Nécessaire au maintien de I'homéostasie du système nerveux central, ce filtre sélectif reste un problème pour le traitement des maladies cérébrales. Afin de recréer les interactions qui existent in vivo et d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent le passage des molécules vers le cerveau, nous avons établi un modèle de barrière hémato-encéphalique in vitro. Ce modèle consiste en une coculture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales ensemencées de part et d'autre d'un filtre. Dans ces conditions de culture, nous avons démontré que les cellules endothéliales exprimaient toutes les caractéristiques, tant physiques que métaboliques, de l'endothélium invivo. Ces résultats font de notre modèle un outil pertinent et précieux dans le développement de nouvelles molécules à visée cérébrale

Transfert cérébral et neuroprotection (Cerebral Transfer and Neuroprotection)

International audienceLes cellules endothéliales de capillaires cérébraux, support anatomique de la barrière hémato-encéphalique, présentent des caractéristiques structurales et métaboliques qui restreignent considérablement les échanges entre le sang et le parenchyme cérébral. Nécessaire au maintien de I'homéostasie du système nerveux central, ce filtre sélectif reste un problème pour le traitement des maladies cérébrales. Afin de recréer les interactions qui existent in vivo et d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent le passage des molécules vers le cerveau, nous avons établi un modèle de barrière hémato-encéphalique in vitro. Ce modèle consiste en une coculture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales ensemencées de part et d'autre d'un filtre. Dans ces conditions de culture, nous avons démontré que les cellules endothéliales exprimaient toutes les caractéristiques, tant physiques que métaboliques, de l'endothélium invivo. Ces résultats font de notre modèle un outil pertinent et précieux dans le développement de nouvelles molécules à visée cérébrale

TNF-α and IL-1β Modulate Blood-Brain Barrier Permeability and Decrease Amyloid-β Peptide Efflux in a Human Blood-Brain Barrier Model

International audienceThe blood-brain barrier (BBB) is a selective barrier and a functional gatekeeper for the central nervous system (CNS), essential for maintaining brain homeostasis. The BBB is composed of specialized brain endothelial cells (BECs) lining the brain capillaries. The tight junctions formed by BECs regulate paracellular transport, whereas transcellular transport is regulated by specialized transporters, pumps and receptors. Cytokine-induced neuroinflammation, such as the tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β), appear to play a role in BBB dysfunction and contribute to the progression of Alzheimer’s disease (AD) by contributing to amyloid-β (Aβ) peptide accumulation. Here, we investigated whether TNF-α and IL-1β modulate the permeability of the BBB and alter Aβ peptide transport across BECs. We used a human BBB in vitro model based on the use of brain-like endothelial cells (BLECs) obtained from endothelial cells derived from CD34+ stem cells cocultivated with brain pericytes. We demonstrated that TNF-α and IL-1β differentially induced changes in BLECs’ permeability by inducing alterations in the organization of junctional complexes as well as in transcelluar trafficking. Further, TNF-α and IL-1β act directly on BLECs by decreasing LRP1 and BCRP protein expression as well as the specific efflux of Aβ peptide. These results provide mechanisms by which CNS inflammation might modulate BBB permeability and promote Aβ peptide accumulation. A future therapeutic intervention targeting vascular inflammation at the BBB may have the therapeutic potential to slow down the progression of A

Cyclodextrins as Emerging Therapeutic Tools in the Treatment of Cholesterol-Associated Vascular and Neurodegenerative Diseases

International audienc

Behavior of α-, β-, and γ-cyclodextrins and their derivatives on an in vitro model of blood-brain barrier

International audienceCyclodextrins (CDs) can be envisaged to cure some diseases related to the brain, but the behavior of these compounds toward the blood-brain barrier (BBB) remains largely unexplored to envisage such clinical applications. To fulfill this gap, the toxicity and endothelial permeability for native, methylated, and hydroxypropylated α-, β-, and γ-CDs have been studied on an in vitro model of BBB. As shown by the endothelial permeability for sucrose and immunofluorescence stainings, the native CDs are the most toxic CDs (α- > β- > γ-CD). Whereas the chemical modification of β-CD did not affect the toxicity of this CD, differences are observed for the α- and γ-CD. To determine the origin of toxicity, lipid effluxes on the brain capillary endothelial cells were performed in the presence of native CDs. It was found that α-CD removed phospholipids and that β-CD extracted phospholipids and cholesterol. γ-CD was less lipid-selective than the other CDs. Finally, the endothelial permeability of each CD has been determined. Surprisingly, no structure/ permeability relationship has been observed according to the nature and chemical modifications of CDs

Methylated β-cyclodextrin as P-gp modulators for deliverance of doxorubicin across an in vitro model of blood-brain barrier

International audienceCo-incubations of various β-cyclodextrins and doxorubicin have been evaluated on an in vitro model of blood-brain barrier in order to increase the delivery of this P-gp substrate to the brain. Among these cyclodextrins used, the Rame-β-cyclodextrin and Crysme-β-cyclodextrin increased the transport by a factor of 2 and 3.7, respectively. This increase was attributed to the cholesterol extraction property of these cyclodextrins from brain capillary endothelial cells leading to a modulation of the P-gp activity

Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: Use of an in vitro model

International audienceBrain is the most cholesterol rich organ of the whole body and recent studies suggest a role for the blood-brain barrier (BBB) in cerebral cholesterol homeostasis. Low density lipoprotein receptor (LDLR)-related receptors and ATP-binding Cassette (ABC) transporters play an important role in peripheral sterol homeostasis. The purpose of this study was to determine the mRNAexpression profiles of ABC transporters (ABCA1, 2, 3, 7 and ABCG1) and low density lipoprotein receptor (LDLR)-related receptors (LDLR, vLDLR, LRP1, LRP2 and LRP8) in BBB endothelium using an in vitro co-culture model of bovine brain capillary endothelial cells (BCECs) and rat glial cells. All transcripts tested are expressed by BCECs and in capillary extract, except vLDLR. Glial cells influence ABCG1, A1, 2, 7 and LRP1 transcription, suggesting a role in cerebral lipid supply/elimination through the modulation of the expression of these transporters and receptors by these cells. Altogether, these results highlight the importance of glial input in the BBB transport phenotype for sterol homeostasis in the central nervous system, and confirm the importance of the BBB in this process

Cross-talk between brain capillary endothelial cells and astrocytes: upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier

International audienceIn contrast to the endothelial cells in large vessels where low density lipoprotein receptors are down-regulated, brain capillary endothelial cells in vivo express an LDL receptor. Using a cell culture model of the blood-brain barrier consisting of a coculture of brain capillary endothelial cells and astrocytes, we observed that the capacity of endothelial cells to bind LDL is enhanced 3 fold when cocultured with astrocytes. We next investigated the ability of astrocytes to modulate endothelial cell LDL receptor expression. We have shown that the lipid requirement of astrocytes increases the expression of endothelial cell LDL receptors. Experiments with dialysis membranes of different pore size showed that this effect is mediated by a soluble factor(s) with a molecular mass somewhere between 3,500 and 14,000. Substituting astrocytes with smooth muscle cells or brain endothelium with endothelium from the aorta or the adrenal cortex did not enhance the luminal LDL receptor expression on endothelial cells, demonstrating the specificity of the interactions. This study demonstrates that a cross-talk takes place between brain capillary endothelial cells and astrocytes