International standardization of an LC-MS/MS based food analytical method: development of a generally accepted test procedure for Alternaria toxins

There are more than seventy varieties of Alternaria toxins, but researchers have so far identified only a few of them structurally. The objective of this paper is to present a nearly ten-year process, during which an international standard for the simultaneous analysis of five Alternaria toxins in food samples was developed. This long process includes the development of the need for the standard and, in addition to the preparation and evaluation of the standardization tender, the development of the method, its validation and documentation. The paper focuses mainly on the development and validation of the analytical method, which is the longest and most labor-intensive part of the process, but in order to understand the overall picture, it is also necessary to emphasize the first and final steps. The development of a standard is a task of great responsibility for both the preparers of the standard and those involved in the validation and documentation of the standard, as the use of standardized methods is expected by the customers of the laboratories. On the other hand, laboratories that choose unique, self-developed methods can ascertain the accuracy and precision of their procedure by comparing them with the standard method. In this process that went on for nearly ten years, the original analytical method underwent several changes; the goal of these improvements was to make the procedure as simple and reproducible as possible. This is how the use isotope dilution mass spectrometry was reached through derivatization. It is important to emphasize that one of the goals of standardization is to have an appropriate analytical method available to authority laboratories for the testing of legally prescribed food contaminants, which procedure is available to any laboratory, however, it is questionable, whether the cost of the test covers its application. Consequently, it is not necessarily the most cost-effective analysis which is recommended by the standard, which may be the cause of conflict between the professional and economic managers of a laboratory in the case of private laboratories. The final form of the liquid chromatography/isotope dilution mass spectrometry (LC-IDMS) standard method developed for Alternaria toxins is likely to be approved and published by the European Committee for Standardization (CEN) in the end of 2021 (the standard has been issued since the article was submitted: CEN EN 17521:2021 Foodstuffs - Determination of Alternaria toxins in tomato, wheat and sunflower seeds by SPE clean-up and HPLC-MS/MS. The Editor). The standard will contain the determination of tenuazonic acid (TEA), altenuane (ALT), alternariol (AOH), tentoxin (TEN) and alternariol monomethyl ether (AME)

Determination of polar target components: HILIC-MS methods in food analysis

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, abbreviated HILIC, has become one of the most dynamically developing branches of the liquid chromatography technique in recent years. Coupled with mass spectrometry detectors, HILIC-MS systems allow the separation of target components in complex samples, such as foodstuffs of plant or animal origin and feeds, that have been difficult or impossible to retain and detect using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) earlier. This paper presents the possibility of using HILIC-MS to determine polar compounds through four specific examples. The test procedures presented include the analysis of a carcinogenic food contaminant, acrylamide, the determination of which in certain food groups is required by law. A further objective of this manuscript is to provide a detailed overview of the HILIC-MS method developed for the detection of water-soluble B vitamins added to foods. Several international standards have been developed for the analysis of B vita-mins, which offer determinations for each vitamin B separately. in comparison, most B vitamins can be measured together using the HILIC-MS technique. This option could be a big step forward for laboratories that analyze B vitamins regularly in a large number of samples. For people living with food intolerance, it is important to know the lactose content of milk-based foods. The HILIC-MS coupled system can also provide a fast and accurate solution for the detection of lactose present in low concentrations, the presentation of which is also the subject of this dissertation. Finally, the paper includes the determination of urea in feed samples. The law prescribes a photometric measurement of urea, but the reliability of this procedure at low concentration levels has been questioned and thus the HILIC-MS method has become prominent as an alternative solution. The applicability of the present analytical methods has been confirmed by successful participation in international proficiency testing programs, sufficiently accurate concentrations detected in control samples, and the certification of fully vali-dated methods by the National Accreditation Authority (NAH)

Egy LC-MS/MS alapú élelmiszer-vizsgálati módszer nemzetközi szabványosítása: egységesen elfogadott vizsgálati eljárás kidolgozása Alternaria toxinokra

Az Alternaria toxinoknak több mint hetven fajtája létezik, de kutatók szerkezetileg eddig még csak párat azonosítottak közülük. Jelen közlemény célja egy majdnem tíz éves folyamat bemutatása, amelynek során nemzetközi szabványt dolgoztunk ki öt Alternaria toxin élelmiszermintákból történő szimultán vizsgálatára. Ez a hosszú folyamat magában foglalja a szabvány igényének a kialakulását, a szabványosítási pályázat kiírásán és elbírálása mellett a módszer kidolgozását, annak érvényesítését, valamint dokumentációját. A dolgozat főképp a vizsgálati módszer kialakítására és validálására összpontosít, amely a folyamat leghosszabb és legmunkaigényesebb része, de az összkép megértése végett az első és a végső lépések hangsúlyozása szintén szükséges. A szabvány kidolgozása felelősségteljes feladat mind a szabványt készítők, mind pedig a szabvány validálásában és annak dokumentációjában résztvevők részéről, a laboratóriumok megrendelői ugyanis a szabványos módszerek használatát várják el tőlük. Másfelől az egyedi, saját kidolgozású módszereket választó laboratóriumok a szabványmódszerrel történő összemérésük során bizonyosodhatnak meg eljárásuk pontosságáról és precizitásáról. A közel tíz éven keresztül zajló folyamatban az eredeti vizsgálati módszer több változtatáson is átesett; ezeknek a javításoknak a célja a minél egyszerűbb és reprodukálhatóbb eljárás volt. Így jutottunk el a származékképzésen át az izotóphigításos tömegspektrometria alkalmazásáig. Fontos hangsúlyozni, hogy a szabványosítás egyik célja az, hogy a jogszabályokban előírt élelmiszerszennyezők vizsgálatához egy megfelelő vizsgálati módszer álljon a hatósági laboratóriumok rendelkezésére, amely eljárás ugyan bármelyik laboratórium számára elérhető, viszont kérdéses, hogy a vizsgálat költsége fedezi-e annak alkalmazását. Ebből adódik, hogy nem feltétlenül a legköltséghatékonyabb vizsgálatot ajánlja a szabvány, ami a magán laboratóriumokban konfliktust okozhat a laboratórium szakmai és gazdasági irányítói között. Az Alternaria toxinokra kidolgozott folyadékkromatográfiás izotóphigításos tömegspektrometriai (LC-IDMS) szabványmódszer végső formáját valószínűleg 2021 végén foga jóváhagyni és közölni az Európai Szabványügyi Bizottság (CEN) (a szabvány a cikk beküldése óta megjelent: CEN EN 17521:2021 Foodstuffs - Determination of Alternaria toxins in tomato, wheat and sunflower seeds by SPE clean-up and HPLC-MS/MS. A szerk.). A szabvány a tenuazonsav (TEA), altenuane (ALT), alternariol (AOH), tentoxin (TEN) és alternariol monometil éter (AME) meghatározását tartalmazza

Poláros célkomponensek meghatározása: HILIC-MS módszerek az élelmiszer-analitikában

A hidrofil kölcsönhatási folyadékkromatográfia (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC) az elmúlt években a folyadékkromatográfiás technika egyik legdinamikusabban fejlődő ága lett. Tömegspektrometrometriás elven működő detektorokkal összekapcsolva a HILIC-MS rendszerek lehetővé teszik a korábban a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) nehezen vagy egyáltalán nem visszatartható és detektálható célkomponensek elválasztását olyan komplex mintákban, mint például a növényi vagy az állati eredetű élelmiszerek, takarmányok. Jelen dolgozat négy konkrét példán keresztül mutatja be a HILIC-MS alkalmazásának lehetőségét poláros vegyületek meghatározása esetében. A bemutatott vizsgálati eljárások között szerepel olyan élelmiszer-szennyező karcinogén anyag vizsgálata, mint például az akrilamid, amelynek bizonyos élelmiszercsoportokban történő meghatározását jogszabály írja elő. Ennek a dolgozatnak a célja továbbá az élelmiszerekhez adott vízoldható B-vitaminok kimutatására kidolgozott HILIC-MS módszer részletes áttekintése. A B-vitaminok vizsgálatára több nemzetközi szabvány is készült, amelyek az egyes B-vitamintípusoknak megfelelően ajánlanak meghatározást. Ehhez képest HILIC-MS technikával a legtöbb B-vitamin együtt mérhető. Ez a vizsgálati lehetőség nagy előrelépést jelenthet a B-vitaminokat rendszeresen és nagy mintaszámmal vizsgáló laboratóriumok számára. Az ételintoleranciával élők számára fontos a tej alapú élelmiszerek laktóz tartalmának ismerete. A kis koncentrációban jelenlevő laktóz kimutatására szintén a HILIC-MS kapcsolt rendszer adhat gyors és pontos megoldást, amelynek bemutatása szintén dolgozatom tárgyát képezi. Végezetül a dolgozatban szerepel a karbamid (urea) takarmánymintákban történő meghatározása is. A jogszabály fotometriás mérést ír elő az ureára, ennek az eljárásnak a megbízhatósága kis koncentrációs szinteken azonban megkérdőjeleződött, ezért alternatív megoldásként előtérbe került a HILIC-MS módszer. Jelen vizsgálati módszerek alkalmazhatóságát igazolja a nemzetközi körvizsgálatokban való eredményes részvétel, a kontroll mintákban detektált kellően pontos koncentrációk, valamint a teljeskörűen validált módszerek tanúsítása a Nemzeti Akkreditáló Hatóság (NAH) által

Analysis of steroid derivatives by LC-MS/MS methods: selective sample preparation procedures by using mixed-mode solid phase extraction and pH control

The analysis of veterinary drug residues and banned crop yield boosters in foods of animal origin is one of the largest and most important areas of food analysis. A prerequisite for effective tests is the development of accurate methods that satisfy the requirements of today’s analysis for selectivity, low limits of detection and accuracy. The high sensitivity and selectivity of liquid chromatographic triple quadrupole tandem mass spectrometric (LC-MS/MS) methods allows for the detection of trace amounts of the organic target compounds even in complex samples. However, the reliability of LC-MS/MS methods depends greatly on the sample preparation preceding the analysis, the objective of which is to decrease the concentrations of matrix components coeluting with the target compounds, thus minimizing the matrix effect in the ion source of the instrument. During sample preparation, low performance liquid chromatographic clean-up, the so-called solid phase extraction (SPE) is often used. The pH of the eluent is one of the most important parameters in liquid chromatography, and so the proper selection of pH during extraction can have a a critical influence on sample preparation and, consequently, the accuracy of the analysis. This statement holds especially true when matrix compounds with functional groups susceptible to protonation have to be removed from the analytical sample. The objective of this paper is to present mixedmode SPE sample preparation methods that demonstrate clearly the necessity for pH control during the extraction. Examples include the determination of both neutral and basic target compounds using mixed-mode strong ion exchange SPE columns

Folyadékkromatográfiás hármas kvadrupol rendszerű tandem tömegspektrometriás (HPLC-MS/MS) módszerek az élelmiszervizsgálatokban: kihívások és előnyök = Challenges and advantages in food analysis based on high performance liquid chromatorgaphy triple quadrupole tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

Az Európai Unióban az Európai Bizottság 37/2010-es rendelete határozza meg az állatgyógyászati szerek maradékainak határértékét az állati eredetű élelmiszerekben. A reziduumok analízise legtöbbször folyadékkromatográfiás elválasztástechnikai megoldást igényel optikai vagy tömegspektrometriás detektálással. Az utóbbi detektálási mód mára széleskörűen elterjedt az élelmiszervizsgáló laboratóriumokban, és nagyfokú szelektivitásának köszönhetően viszonylag egyszerűen alkalmazható komplex minták mérésére. A folyadékkromatográfiás elválasztással kapcsolt tömegspektrometriás detektálás esetén gyakorlatilag a minta-előkészítést egyetlen szilárd-folyadék extrakcióra és azt követő hígításra vagy oldószercserére lehet leegyszerűsíteni, ha szűrő (screening) módszerként kívánjuk alkalmazni az eljárást. Megerősítő (konfirmációs) módszernek használva az említett kapcsolt technikát, a mintatisztítás (clean-up) nélküli eljárás már csak izotóphígításos módszerrel összekötve valósítható meg az esetek többségében. Ugyanis a viszonylagos egyszerűséggel szemben a folyadékkromatográfiás - tömegspektrometriás módszerek az interferencia nélküli mérés ellenére is alapos optimálást igényelnek mind a minta-előkészítésben, mind az azt követő műszeres analízisben, mert a célkomponensekkel ko-eluálódó és méréstechnikailag láthatatlan mátrixalkotók a meghatározások pontosságát nagymértekben befolyásolhatják. A mátrixhatások kompenzációjára mátrixból felvett, mátrix alapú kalibrációt vagy izotóphígításos módszert szoktak alkalmazni, de ezen eljárások se adnak mindig jó vagy egyáltalán elérhető megoldást, így az optikai detektálás olykor jobbnak bizonyul (pl.: tetraciklinek meghatározása). Az izotóphígításos módszerek egy különleges változata a „pontosan egyező dupla izotóphígításos módszer” (exact-matching double isotope dilution mass spectrometry), amelynek elsődleges helye van kontrolminták referencia értékeinek meghatározásában. In the Europea Union, maximum residue limits of pharmacologically active substances are determined by Commission Regulation (EU) No 37/2010. Residue analysis usually requires liquid chromatographic separation, coupled with optical or mass spectrometric detection. The latter detection method has become widespread by now in food testing laboratories and, because of its high selectivity, it can be used relatively easily for the measurement of complex samples. In the case of mass spectrometric detection coupled with liquid chromatographic separation, sample preparation can be reduced practically to a solid-liquid extraction, followed by a dilution or a solvent exchange, if the procedure is to be used as a screening method. When using the abovementioned coupled technique as a confirmation method, in most cases a procedure without clean-up can only be achieved by coupling with an isotope dilution method. This is so, because - despite their relative simplicity and despite being a measurement with no interference - liquid chromatographic-mass spectrometric methods require thorough optimization both in sample preparation and in the subsequent instrumental analysis, because the accuracy of the measurements could be greatly influenced by matrix components that are co-eluted with the target components but which are invisible to the measurement technique. To compensate for matrix effects, matrix-matched calibration or the isotope dilution method is usually used, but even these procedures do not always provide good or even available solutions, and so optical detection sometimes proves to be better (e.g. the determination of tetracyclines). A unique variation of the isotope dilution method is the exact-matching double isotope dilution mass spectrometry, which has a special place in the determination of the reference values of control samples

High performance residue analysis: determination of antibacterial agents in foods using liquid chromatography screening and confirmation methods

In Hungary, food toxicology monitoring and control analyses, their course and the process of preparation of the monitoring plan for the given year are prescribed and determined by FVM decree 10/2002. (I. 23.). The efficiency of monitoring analyses is increased if the focus is placed primarily on screening methods, and independent confirmation methods are used to test objectionable samples. This allows for the distinguishing between negative samples and those containing drug residues using a simpler, faster and cheaper screening type method, and also for higher certainty in the qualitative and quantitative evaluation of positive samples. The objective of this paper is to present an analytical concept developed for antibacterial agents, including a multicomponent screening method and independent confirmation measurements for type B1 authorized agents. The screening method allows for the simultaneous identification and semiquantitative evaluation of 54 components with drug residue limit values and griseofulvin in animal tissues (muscle, liver and kidney), milk, eggs and honey, using a liquid chromatography triple quadrupole tandem mass spectrometry method. Target components detected by the screening method are identified using liquid chromatography confirmation tests and evaluated by optical or tandem mass spectrometric detection. Up until the submission date of this paper, nearly 1,800 samples had been analyzed by the screening method. Some type of drug residue was detected in 24 monitoring samples. The contaminations could also be detected during the confirmation tests. The analytical strategy thus developed has been proven to be effective in multiple international proficiency testing programs

Szteroidszármazékok LC-MS/MS módszerű analízise: szelektív minta-előkészítési eljárások kevert módú szilárd fázisú extrakció és pH-kontroll alkalmazásával

Az állatgyógyászati szerek maradékainak és a tiltott hozamfokozóknak a vizsgálata az állati eredetű élelmiszerekben az élelmiszer-vizsgálatok egyik legnagyobb és fontosabb területe. A hatékony vizsgálatok feltétele olyan precíz módszerek kidolgozása, amelyek kielégítik a modern analitika szelektivitásra, alacsony kimutatási határra és pontosságra vonatkozó követelményeit. A folyadékkromatográfiás hármas kvadrupol rendszerű tandem tömegspektrometriás (LC-MS/MS) módszerek nagyfokú érzékenysége és szelektivitása lehetőséget biztosít a szerves célvegyületek nyomnyi kimutatására összetett minták esetén is. Az LC-MS/MS módszerek megbízhatósága ugyanakkor nagymértékben függ az analízist megelőző minta-előkészítéstől, amelynek lényege a célvegyületekkel együtt eluálódó mátrixalkotók koncentrációjának csökkentése, ezáltal a mátrixhatás minimalizálása a készülék ionforrásában. Gyakran alkalmaznak a minta-előkésztések során kis hatékonyságú folyadékkromatográfiás tisztítást, az ún. szilárd fázisú extrakciót (Solid Phase Extraction -SPE). Az eluens kémhatása a folyadékkromatográfiában az egyik legfontosabb paraméter, így a pH megfelelő megválasztása az extrakció során döntően befolyásolhatja a minta-előkészítést és ez által az analízis pontosságát. Különösen helytálló ez a megállapítás akkor, amikor protonfunkciós mátrixvegyületeket kell eltávolítani a vizsgálati mintából. Közleményünk célja olyan kevert módú SPE minta-előkészítések bemutatása, amelyek jól demonstrálják a pH-kontroll szükségét az extrakció során. A példák között neutrális és bázikus jellegű célvegyületek meghatározása is szerepel kevert módú erős ioncserélő SPE oszlopok alkalmazásával

Determination of fat-soluble vitamins A, D2, D3, E and K3 by isotope dilution and LC-MS/MS instrument assembly

The purpose of our publication is the determination of the total amount (of natural origin and added) of fat-soluble vitamins A, D2, D3 and E in low amounts in foods (wheat flour, soft drinks, effervescent tablets) and dietary supplements using a liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method. The samples were diluted with isotope-labeled derivatives of the target components (vitamin A-d6, vitamin D2-d3, vitamin D3-d3, vitamin E-d6), and after extraction and saponification, they were purified by liquid-liquid extraction. After a solvent exchange, the concentration of the vitamins was determined on a C8 HPLC column using acidic mobile phases (0.1% formic acid in water/methanol) and LC-MS/MS technique. In dietary supplements, the analysis of the fat-soluble vitamin K3 may also be important, because the use of vitamin K3 is currently not approved in human formulations. During the determination of vitamin K3, saponification is not necessary, due to its structure, alkaline hydrolysis would lead to the decomposition of vitamin K3, so this component was analyzed by a method different from the one used for the other vitamins. LC-MS/MS analysis of small amounts of vitamin K3 is more complicated than that of other vitamins due to the low sensitivity of the MS instrument to vitamin K3. The determination of vitamin K3 was therefore carried out after chemical derivatization with L-cysteine as a derivatizing reagent, also with isotope dilution and LC-MS/MS technique. After intralaboratory validation, the methods were successfully used in domestic and international proficiency tests in infant formulas and liquid vitamin preparations

Nagyhatékonyságú szermaradék-vizsgálat: antibakteriális szerek meghatározása élelmiszerekből folyadékkromatográfiás szűrő és megerősítő módszerekkel

Magyarországon a 10/2002 (I.23.) FVM rendelet írja elő és határozza meg az élelmiszer toxikológiai megfigyelő vizsgálatokat és ellenőrzéseket (monitoring vizsgálatok), azok menetét és az adott évi monitoringterv elkészítésének folyamatát. A monitoringmérések hatékonyságát növeli, hogyha a hangsúlyt elsődlegesen a szűrővizsgálatokra (screening) helyezzük, és a kifogásolható minták elemzésére független megerősítő (konfirmációs) eljárásokat alkalmazunk. Ezáltal lehetőség nyílik egy egyszerűbb, gyorsabb és olcsóbb szűrő jellegű méréssel megkülönböztetni a negatív mintákat a szermaradék-tartalmúaktól, illetve nagyobb bizonyossággal lehet a mintákat minőségileg és mennyiségileg értékelni pozitivitás esetén. Jelen közlemény célja antibakteriális szerekre kidolgozott vizsgálati koncepció bemutatása, amely magába foglal egy többkomponeses szűrőmódszert és ettől független megerősítő méréseket B1 típusú engedélyezett szerekre. A szűrőmódszer lehetővé tesz 54, szermaradék határértékkel rendelkező, komponens és a griseofulvin szimultán azonosítását és szemi-kvanitatív értékelését állati eredetű szövetekből (izom, máj és vese), tejből, tojásból és mézből folyadékkromatográfiás hármas kvadrupol rendszerű tandem tömegspektrometriai módszerrel. A szűrőmódszerrel detektált célkomponenseket folyadékkromatográfiás megerősítő vizsgálatokkal azonosítjuk és optikai vagy tandem tömegspektrometriai detektálással értékeljük. A szűrőmódszerrel e közlemény benyújtásának időpontjáig közel 1800 mintát elemeztünk. Valamilyen szermaradék 24 monitoringmintában volt kimutatható. A szennyezések a megerősítő vizsgálatok során is detektálhatok voltak. Az így kialakított vizsgálati stratégia nemzetközi körvizsgálatban is többször igazolta hatékonyságát