Liposome retention in size exclusion chromatography

BACKGROUND: Size exclusion chromatography is the method of choice for separating free from liposome-encapsulated molecules. However, if the column is not presaturated with lipids this type of chromatography causes a significant loss of lipid material. To date, the mechanism of lipid retention is poorly understood. It has been speculated that lipid binds to the column material or the entire liposome is entrapped inside the void. RESULTS: Here we show that intact liposomes and their contents are retained in the exclusion gel. Retention depends on the pore size, the smaller the pores, the higher the retention. Retained liposomes are not tightly fixed to the beads and are slowly released from the gels upon direct or inverted eluent flow, long washing steps or column repacking. Further addition of free liposomes leads to the elution of part of the gel-trapped liposomes, showing that the retention is transitory. Trapping reversibility should be related to a mechanism of partitioning of the liposomes between the stationary phase, water-swelled polymeric gel, and the mobile aqueous phase. CONCLUSION: Retention of liposomes by size exclusion gels is a dynamic and reversible process, which should be accounted for to control lipid loss and sample contamination during chromatography

Caractérisation de systèmes mixtes a-cyclodextrine/lipide lyotrope

Les travaux effectués au cours de cette thèse portent sur les intéractions entre deux familles de molécules capables individuellement de former des édifices supramoléculaires organisés à l'échelle nanométrique: les cyclodextrines qui sont des macrocycles capables de former des complexes de type "hôte-invité" et les lipides polaires lyotropes qui sont dotés de propriétés uniques d'auto-organisation et de compartimentation de l'eau au sein d'architectures très variées. Nous nous sommes intéressés plus particulièrement aux édifices formés à partir de deux types de lipides ayant des propriétés de solubilité dans l'eau différentes: en premier lieu, un agent de surface soluble non-ionique dérivé de sucre: l'octyl-b-D-glucopyranoside et, en second lieu, différents lipides polaires lyotropes de classe II (quasi-insolubles dans l'eau) provenant tous de la famille des phosphatidylcholines.In this work, the aim was to investigate the interactions between two families of molecules which can be individually organizing a wide variety of supramolecular assemblies. The first family is the cyclodextrins which are known for their ability to form host-guest inclusion complexes with a wide variety of organic and inorganic compounds, changing most of chemical and physical properties of the guest molecules. The second family is the polar lipids which are known for their ability to organize spontaneously into a wide variety of supramolecular assemblies including liquid crystalline structures of different topologies such as a cubic, hexagonal or lamellar structures, micelles, microemulsions and vesicles. We were more particularly interested in buildings formed from two types of lipids having several properties of solubility in water: the first is a non-ionic alkyl glycosides, the octyl b-D-glucopyranoside, and, the secondly is polar lipids of class II, the phosphatidylcholine.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Développement et caractérisation de nouveaux agents de contraste lipidiques ultrasensibles pour l'imagerie par résonnance magnétique destinés à l'imagerie moléculaire

L effet des composés paramagnétiques sur le déplacement chimique des protons, c est-à-dire sur leur fréquence de résonance propre, beaucoup utilisé en RMN conventionnelle, peut également être un outil de contraste en Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour réaliser des images encodées en fréquence et donc sélectives selon la nature ou l environnement de l entité que l on cherche à révéler. Cette approche fait intervenir le transfert d aimantation par échange chimique de protons mobiles, en anglais Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST). Le principe consiste à saturer sélectivement un signal donné de protons labiles appartenant à la structure-même de l agent de contraste ou aux molécules d eau qui lui sont transitoirement liées, à l aide d une impulsion radiofréquence bien choisie. L image résulte alors de l altération du signal des protons échangés. Le fonctionnement de la méthode repose sur l existence effective de deux ensembles ou réservoirs de protons, celui correspondant aux protons associés à l agent de contraste et celui représenté par le milieu environnant, autrement dit l eau des tissus, ces deux réservoirs présentant une fréquence de résonance bien distincte. Les systèmes LipoCEST, liposomes encapsulant un complexe paramagnétique de lanthanide, permettent une telle différenciation de deux réservoirs de protons constitutifs d une part de l eau contenue dans la cavité interne des liposomes (dont la fréquence de résonance est modifiée par l agent paramagnétique) et d autre part de l eau présente à l extérieur de la structure. La sensibilité de tels systèmes est principalement due au grand nombre de protons contenus dans le réservoir interne. La nature de l agent paramagnétique joue un rôle déterminant dans la sélectivité de l effet CEST et la nature de la membrane des liposomes dont la perméabilité permet un échange plus ou moins rapide entre les deux réservoirs d eau doit être sélectionnée de manière à conduire à une réponse CEST efficace.Les travaux réalisés au cours de cette thèse portent sur une telle mise au point avec pour objectif l optimisation de systèmes destinés à une IRM-CEST après administration par voie intraveineuse. De ce fait, le diamètre des liposomes a été fixé inférieur à 200 nm et leur surface recouverte de chaînes de poly(éthylène glycol) pour assurer leur future stabilité dans le compartiment sanguin. Le choix des agents de déplacement chimique à centre lanthanide, principalement des complexes de thulium, a été fixé à partir de leurs propriétés structurales et magnétiques. La méthodologie spécialement développée pour encapsuler ces entités au sein de liposomes de compositions lipidiques induisant des perméabilités membranaires distinctes a permis la mise au point d un nouvel agent de contraste LipoCEST.The effect of paramagnetic compounds in the chemical shift of endogenous protons, i.e., their resonance frequency, widely used in conventional NMR, can also be a tool to modulate the contrast in magnetic resonance imaging (MRI) by achieving frequency-encoded images depending on the nature or the environment of the entity or tissue to be revealed. This approach involves the transfer of magnetization by chemical exchange of protons also referred to as "Chemical Exchange Saturation Transfer" (CEST). The principle consists in selectively saturate by applying a radio frequency pulse, the signal of labile protons transiently belonging to the structure of the contrast agent or to the water molecules which are associated transiently to it. The image then results from the alteration of the signal of the exchanged protons. The method is based on the actual existence of two sets of protons or pools with two distinct resonance frequencies, one corresponding to the protons associated with the contrast agent and the other represented by the surrounding bulk water.LipoCEST systems, liposomes encapsulating a paramagnetic lanthanide complex, allows such a differentiation of two proton pools constituted on one hand by the water molecules contained in the inner cavity of the liposomes (with a resonance frequency changed by the paramagnetic agent ) and on the other hand by the water present outside the vesicle structure. The sensitivity of such systems is mainly due to the large number of protons in the inner pool. The nature of the paramagnetic agent plays a role in the selectivity of the CEST effect while the nature of the liposome membrane and related permeability behavior controls the proton exchange kinetics between the two water pools. These two parameters must be selected and adjusted to provide effective CEST contrast.The work in this thesis aimed at such a development by optimizing liposome systems for MRI-CEST after intravenous administration. Therefore, the diameter of the liposomes was set below 200 nm and their surface covered by chains of poly (ethylene glycol) to ensure stability in the blood compartment. The choice of chemical shift agents based on lanthanide complexes, mainly thulium-based derivatives, was established from their structural and magnetic properties. The methodology specially developed to encapsulate these entities into vesicles of different membrane composition and permeability to water allowed to generate a new LipoCEST contrast agent.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Magnétoliposomes pour le diagnostic et le traitement du glioblastome par vectorisation magnétique et hyperthermie

L ensemble de l étude in vivo réalisée sur souris porteuses de glioblastome U87 démontre la faisabilité du ciblage magnétique pour accumuler les magnétoliposomes superparamagnétiques, ou MFLs, au niveau du glioblastome, tout en préservant le reste du tissu cérébral sain. L étude révèle que le bénéfice apporté par l action d un gradient de champ magnétique produit par un aimant extracorporel repose sur un effet EPR ( enhanced permeation and retention effect) amplifié. Les résultats sont étayés par la combinaison de plusieurs techniques (IRM, RPE, microscopie confocale de fluorescence, microscopie électronique). Concernant les mécanismes de transport empruntés par les magnétoliposomes pour atteindre les cellules tumorales, la voie d endocytose non spécifique s apparentant à un processus de macropinocytose est pressentie. Dans l optique d une application thérapeutique par hyperthermie, la capacité d échauffement des magnétoliposomes a été pour la première fois explorée. Les résultats prouvent un comportement thermique des magnétoliposomes compatible avec les conditions d un traitement par hyperthermie. Enfin, dans le cadre d une étude portant sur le développement de cancers mécano-induits, l application des magnétoliposomes a été élargie un autre organe non étudié à ce jour, le côlon. Ces travaux illustrent la problématique de la vectorisation magnétique au sein d un organe situé dans une région interne de l organisme.First, the in vivo study on U87-glioblastoma bearing mice demonstrates the ability of magnetic targeting to accumulate magnetic-fluid-loaded liposomes (MFLs) into glioblastoma while sparing the rest of the healthy brain tissue. The enhancement of liposome local concentration by applying a magnetic field gradient produced by an external magnet is based on an amplified EPR effect ( enhanced permeation and retention effect). The results were supported by combining several techniques (MRI, ESR, confocal fluorescence microscopy, electron microscopy). The investigations concerning the mechanisms of transport of the magnetoliposomes to reach the tumor cells suggest a non-specific endocytose pathway, presumably macropinocytosis. Secondly, in the context of a therapeutic application by hyperthermia the heat capacity of MFLs was explored. The results showed that the thermal behaviour of the magnetoliposomes depends on the containment state of the iron oxide nanocrystals and is compatible with the conditions of hyperthermia treatment. Finally, as part of a study concerning the development of mechanically induced cancers, application of MFLs was extended to target another organ not yet studied: the colon. This work especially illustrates the potential and related limits of magnetic targeting towards an organ located in an inner region of the body.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Technologie de prilling (des principes fondamentaux du procédé au développement de microsphères lipidiques.)

Le travail de recherche mené au cours de cette thèse a été effectué dans le cadre d une collaboration industrielle et a porté sur la technologie de prilling et le développement de microparticules lipidiques par cette technique originale. La première partie de ce travail a consisté à sélectionner des excipients lipidiques puis à étudier leurs comportements lors des deux grandes étapes du procédé : la formation de la goutte par rupture vibrante et la cristallisation par refroidissement brutal dans la tour de prilling. Ces études ont permis de mettre en évidence des paramètres clés pour la réussite du procédé et donc pour la qualité du produit fini : la viscosité et les propriétés thermiques et structurales des lipides. Ces paramètres devront donc faire l objet d une étude systématique avant d envisager leur application à la technologie de prilling. La seconde partie de ce travail concerne la formulation de trois molécules actives par prilling : le Kétoprofène, la Dronédarone et la Fexofénadine. Ces trois exemples ont permis d illustrer différents modes d incorporation du principe actif dans le procédé et leurs problématiques associées : la fusion, la solubilisation ou la mise en suspension d un principe actif dans les excipients fondus.This work was conducted within the framework of an industrial collaboration and focused on the prilling technology and the development of lipid microparticles by this original technique.The first part of this work was to select lipid excipients and to study their behavior in the two main steps of the process: the droplet s formation by vibrating nozzle and the droplet s crystallization by quenching in the prilling tower. These studies highlight the critical key parameters involves in the success of the process and therefore the quality of the final product: viscosity and thermal and structural properties of lipids. These parameters should be therefore systematically studied before considering their application to technology prilling.The second part of this work concerns the formulation of three active molecules by prilling: Ketoprofen, Dronedarone and Fexofenadine. These three examples were used to illustrate different ways of incorporating the active ingredient in the process and their associated problems: the melting, the solubilisation and the suspension of active molecules in melted lipids.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Conception de magnétoliposomes furtifs pour le diagnostic et la thérapie anti-cancéreuse

Un nouveau système hybride résultant de l'encapsulation de nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques dans des vésicules phospholipidiques stabilisées strériquement par des chaînes de poly(éthylène glycol) a été mis au point et caractérisé. Ces magnétoliposomes, stables et biocompatibles sont d'excellents agents de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique, qui, par application d'un gradient de champ magnétique externe, peuvent être guidés in vivo dans le tissu tumoral ou un hémisphère cérébral. In vitro, la présence de chaînes de PEG réduit fortement l'association magnétoliposome/macrophages sans pour autant modifier la cinétique d'endocytose des magnétoliposomes une fois ceux-ci liés à la surface des cellules. Dans le cas de cellules d'adénocarcinome prostatique humain, il a été montré que l'internalisation cellulaire des magnétoliposomes pouvait être nettement favorisée en présence d'un gradient de champ magnétique.A novel hybrid nanosystem, resulting from the encapsulation of iron oxid nanoparticles into stercally stabilised phospholipidic vesicles, has been realised and characterised. These socalled magnetoliposomes, revealed as excellent MRI contrast agents, could be guided towards a tumor tissue or a cerebral hemisphere thanks to an external magnetic gradient.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF

Nanoformulations pour la protection de flavonoïdes instables (exemple de la quercétine)

Cette thèse porte sur la mise au point de formulations de nanoparticules lipidiques à base de polyoxylglycérides afin d assurer la protection de principes actifs instables chimiquement et physiquement, la quercétine (un flavonoïde antioxydant fragile) dans le cas présent. Différents systèmes dispersés ont été préparés par homogénéisation haute pression à chaud avec une taille des particules blanches entre 100 - 200 nm. Ces nanodispersions sont très stables sur plusieurs années à température ambiante. L encapsulation de la quercétine, dans les nanoparticules lipidiques multicompartimentées et la préparation de nanocristaux ont permis d augmenter fortement sa teneur dans la dispersion et d améliorer effectivement sa stabilité physico-chimique.This thesis focuses on the development of polyoxylglycérides-based lipid nanoparticles to protect labile APIs, quercetin (a fragile antioxidant flavonoid) in this case. Different nanoparticulate systems were prepared by high pressure homogenization with particle size between 100 to 200 nm. These nanodispersions are very stable over several years at room temperature. Encapsulation of quercetin in compartmented lipid nanoparticles and preparation of nanocrystals have increased significantly its content in the dispersion and effectively improve its physical and chemical stability.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF