Análise integrada comparativa do padrão de expressão de miRNAs e alteração de número de cópias de DNA de portadoras de carcinoma mamário triplo-negativo dos grupos populacionais de negras-americanas, brancas americanas não-hispânicas e brasileiras

Orientadora: Profa. Dra. Enilze M. S. F. RibeiroCoorientadores: Profa. Dra. Luciane R. Cavalli, Prof. Dr. Iglenir J. CavalliTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 23/03/2018Inclui referênciasResumo: As disparidades da saúde consistem em diferenças no status de saúde de indivíduos estratificados em grupos específicos devido a alguma característica ou fator epidemiológico específico. Os tumores mamários triplo-negativos (TNBC) constituem um subtipo de carcinoma mamário clinicamente agressivo, frequentemente diagnosticado em mulheres jovens e de grupos populacionais específicos como negras americanas, hispânicas e latinas. Essas diferenças na incidência e prognósticos do TNBC em determinadas populações indicam a existência de disparidades da saúde do câncer de mama. Os TNBC são um grupo bastante heterogêneo uma vez que são caracterizados apenas pela ausência de expressão dos receptores hormonais de estrogênio e progesterona, e a não superexpressão do HER2. Neste estudo, foram analisados os padrões de alterações de números de cópias de DNA (CNA) e de expressão de microRNA de amostras TNBC e não-TNBC (NTNBC) de pacientes negras americanas (AA), brancas americanas não-hispânicas (NHW) e brasileiras (LA). Um total de 164 amostras foi obtido do Hospital Nossa Senhora das Graças (Curitiba, PR, Brasil) e do Lombardi Comprehensive Cancer Center Georgetown University (Washington, DC, EUA). A análise comparativa da expressão de microRNAs foi realizada entre os subtipos TNBC e NTNBC de cada grupo populacional, resultando em 194 miRNAs diferencialmente expressos (DEmiRNAs) entre as pacientes AA, 336 DEmiRNAs entre as pacientes NHW, e 163 DEmiRNAs entre as pacientes LA. A determinação dos DEmiRNAs entre as amostras AA TNBC e NHW TNBC resultou em 256 miRNAs diferencialmente expressos entre os dois grupos; a análise integrada com dados de CNAs das amostras AA TNBC resultou em um painel de 26 miRNAs que apresentaram dados concordantes de expressão de miRNAs e CNAs. Análises de curva de ROC indicaram um bom poder discriminatório desses miRNAs individuais e do painel em diferenciar as amostras AA TNBC e NHW TNBC. Análises de bioinformática indicaram que os 26 miRNAs podem estar envolvidos em vias de sinalização importantes na carcinogênese como via do PI3K-Akt, MAPK e Insulina. Entre os 26 miRNAs, o miR-150-5p foi selecionado para estudos funcionais que permitiram a determinação de seu potencial oncogênico no câncer de mama, principalmente em AA TNBC. A modulação da expressão do miR-150-5p através da utilização de inibidores e mimetizadores foi realizada seguida de análises da capacidade proliferativa (MTS e Ensaio Clonogênico), migratória, expressão de marcadores de transição epitelial-mesenquimal (EMT) e resistência a tratamento. A análise integrada dos dados de expressão de miRNAs e CNAs das pacientes LA resultou em um painel de 17 miRNAs com dados concordantes das duas análises. Este painel apresentou alto poder de discriminar amostras TNBC e NTNBC de pacientes brasileiras, com valor de AUC de 0.953. Em resumo, foram observadas diferenças biológicas no nível molecular (DNA e RNA) entre os tumores mamários das três populações estudadas que podem auxiliar na elucidação das disparidades de saúde observadas. Estes resultados indicam que os miRNAs são importantes na tumorigênese mamária e a integração com dados de CNAs permitem uma seleção de miRNAs para estudos como biomarcadores de diagnóstico, prognóstico e desenvolvimento de tratamentos. Palavras-chave: Câncer de mama. microRNAs. Disparidades de saúde.Abstract: Health disparities are differences in health status of individuals separated in specific groups because of specific characteristic or epidemiological factor. Triple negative breast cancer (TNBC) is a clinically aggressive subtype of breast cancer frequently presented in younger women from specific populations as African American, Hispanic and Latina. The differences in TNBC incidence and prognosis of specific populations show that breast cancer presents health disparities. TNBC is a highly heterogeneous group of diseases characterized by lack of expression of estrogen and progesterone receptors and lack of superexpression of HER2. In this study we analyzed DNA copy number alterations (CNA) and microRNAS expression patterns of TNBC and non-TNBC samples from African American (AA), non-Hispanic white (NHW) and Brazilian (LA) women. One hundred sixty four samples were obtained from Hospital Nossa Senhora das Graças (Curitiba, PR, Brazil) and Lombardi Comprehensive Cancer Center Georgetown University (Washington, DC, EUA). Comparative analysis of miRNA expression were performed between TNBC and NTNBC samples of each population, resulting in 194 differentially expressed miRNAs (DEmiRNAs) between AA subgroups, 336 DEmiRNAs between NHW subgroups, and 163 DEmiRNAs between LA subgroups. Two hundred and fifty six DEmiRNAs were obtained when AA TNBC and NHW TNBC samples were compared; integrative analysis of miRNA expression and CNA data of TNBC samples resulted in 26 miRNAs with concordant data of both analysis. ROC analysis indicates a good power of both individual miRNAs and combined panel of 26 miRNAs in discriminating AA TNBC and NHW TMBC samples. Bioinformatic analysis indicate that these 26 miRNAs may be involved in important signaling pathways for carcinogenesis, as PI3K-Akt, MAPK and Insulin pathways. Among the 26 miRNAs, miR-150-5p was selected for further functional analysis uncovering its oncogenic potential in breast cancer, especially in AA TNBC. Modulation of miR-150-5p expression by using inhibitors and mimics was performed followed by proliferation (MTS and Clonogenic Assay), migration, epithelial-tomesenchymal transition (EMT) markers expression and cytotoxic assays. Integrative analysis of miRNA expression and CNA data of LA patients resulted in 17 miRNAs with concordant data. This panel presented high power in discriminating TNBC and NTNBC subtypes of the Brazilian patients, with AUC of 0.953. In conclusion, there are biological differences at molecular levels (DNA and RNA) among breast tumors of the three populations of this study that might help elucidate health disparities observed. These results indicate that miRNAs are important for breast tumorigenesis and integration with CNA data allow a fine selection of miRNAs as diagnostic, prognostic biomarkers and for treatment development. Key-words: Breast cancer. microRNAs. Health disparitie

Análise integrada do padrão de expressão de microRNAS e alteração do número de cópias de DNA em tumores de mama triplo-negativos

Orientadora : Profª Drª Enilze M. S. F. RibeiroCo-orientadores : Profª Drª Luciane R. Cavalli, Prof. Dr. Iglenir J. CavalliDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/03/2014Inclui referênciasÁrea de concentração: GenéticaResumo: Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de moléculas de RNA não codificadoras que apresentam um papel na tumorigênese mamária, regulando genes envolvidos no ciclo celular, proliferação celular, invasão e metástase. Os diferentes subtipos de câncer de mama apresentam diferentes padrões de expressão de miRNAs, dessa forma essas moléculas podem ser potenciais marcadores terapêuticos para subtipos agressivos, como os tumores mamários triplo negativos (TN). Os tumores TN são clinicamente agressivos e possuem baixa ou nenhuma expressão dos receptores de estrogênio (ER), progesterona (PR) e HER2, dessa forma não respondem efetivamente a terapias alvos disponíveis atualmente. No presente trabalho, foi analisado o padrão de expressão de miRNAs de 83 tumores TN e 12 não-TN, juntamente com dados de alterações de números de cópias de DNA por array-CGH obtidos das mesmas amostras, a fim de identificar os miRNAs mais relevantes e seus respectivos genes alvos que podem estar envolvidos na patogênese dos tumores de mama TN. 117 miRNAs foram encontrados com expressão diferencial em tumores TN, quando comparados com os não-TN. A análise combinada de miRNA/aCGH resultou em 17 miRNAs que apresentaram dados concordantes de expressão de miRNA e alterações de números de cópias (ganho/perda de aCGH com alta/baixa expressão de miRNA, respectivamente). Análises de sistemas biológicos downstream de alvos conhecidos e possíveis alvos dos miRNAs selecionados indicaram as vias de sinalização do TGF-beta, PI3K-Akt e HER2, assim como vias envolvidas na adesão celular e outros processos relacionados ao câncer. Estes resultados sugerem que os 17 miRNAs e seus respetivos genes alvos podem ser futuramente estudados como marcadores moleculares específicos para tumores TN, sugerindo a necessidade de estudos de análise funcional e biológica que comprovem suas participações na tumorigênese mamária de tumores do tipo TN.Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are a class of non-coding endogenous RNA molecules that play a role in breast tumorigenesis regulating genes involved in cell cycle, proliferation, invasion and metastasis. Different subtypes of breast cancer presents different expression of miRNAs, and they can be potential therapeutic markers for aggressive subtypes as triple negative breast cancers (TNBC). TNBC are clinically aggressive tumors that lack the expression of ER, PR and HER2 receptors, therefore they do not respond effectively to the available target therapies. In the present study, we investigated miRNA expression pattern of 83 TNBC and 12 non-TNBC tumors and integrated the data with DNA copy number alterations data by array-CGH from the same samples, to obtain the most relevant miRNAs and their respective target genes that may be involved in the pathogenesis of TNBC. 117 miRNAs were found as differentially expressed in TNBC, when compared to non-TNBC. The combined analysis (miRNA/aCGH) resulted in 17 miRNAs that presented miRNA concomitant genomic gains and losses by aCGH and miRNA increase or decrease expression, respectively. KEGG pathway enrichment analysis of the selected 17 miRNAs revealed that their main pathways involved in TGF-beta signaling pathway, PI3K-Akt and HER2 signaling pathways as well as the ones involved in adherence junction and other cancer related processes. Our results suggest that the 17 miRNAs and their target genes may be studied as specific molecular markers for TNBC, suggesting the need for functional and biological analysis that proves their roles in TN tumorigenesis

Applicability and reproducibility of acute myeloid leukaemia stem cell assessment in a multi-centre setting

Leukaemic stem cells (LSC) have been experimentally defined as the leukaemia-propagating population and are thought to be the cellular reservoir of relapse in acute myeloid leukaemia (AML). Therefore, LSC measurements are warranted to facilitate accurate risk stratification. Previously, we published the composition of a one-tube flow cytometric assay, characterised by the presence of 13 important membrane markers for LSC detection