Die Funktion der viralen Phospholipase A2 während der Infektion des Adeno-assoziierten Virus 2

Das Adeno-assoziierte Virus (AAV), ein Vertreter der Parvoviridae, wurde zu einem sehr erfolgreichen Vektorsystem entwickelt. Einen wichtigen Beitrag hierzu hat die Verfügbarkeit der verschiedenen Serotypen geleistet. Zwei dieser Serotypen, AAV2 und AAV8, wurden in dieser Arbeit näher untersucht. Beide Serotypen akkumulieren nach intravenöser Gabe in der Leber, aber nur AAV8 vermittelt eine effiziente Transgenexpression. In meiner Arbeit konnte ich deutlich zeigen, dass AAV2 im Gegensatz zu AAV8 in Hepatozyten einen intrazellulären Block erfährt. So wurde AAV2 zwar signifikant effizienter als AAV8 in humane (HepG2) und murine (H2.35) Hepatozyten aufgenommen, aber im Vergleich zu AAV8 waren deutlich mehr intrazelluläre AAV2-Partikel nötig, um in Hepatozyten eine Genexpression zu erreichen. Die Identifizierung des limitierenden Schritts könnte durch die Visualisierung der Transduktion erleichtert werden. Bis zu meiner Arbeit waren mikroskopische Analysen für AAV8 jedoch nicht möglich, da keine Antikörper zur Verfügung stehen. Um diese Limitation zu überwinden, markierte ich das AAV-Kapsid genetisch mit Fluoreszenzproteinen. Hierzu verwendete ich GFP, CFP, DsRed und mCherry, die ich genetisch an den N-Terminus des VP2 fusionierte. Bei der Vektorherstellung werden die Fusionsproteine dann in das Kapsid eingebaut. Die Vektorpräparationen wiesen genomische Titer auf, die mit denen von nicht-markierten Viren vergleichbar waren und konnten erfolgreich zur Visualisierung verwendet werden. Durch diese technische Entwicklung können - wie hier gezeigt - nun auch Ko-Transduktionen mit genetisch-markierten AAV2 und AAV8 Vektoren durchgeführt werden. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte ich die Rolle der Phospholipase A2 (PLA2)-Domäne, die sich in der unique region des VP1 befindet, aufklären. Eine Mutation im katalytischen Zentrum der PLA2 führt zu einer signifikanten Abnahme des infektiösen Titers (Girod et al., 2002). Diese Abnahme begründet sich nicht in einer ineffizienten zellulären Aufnahme, wie ich durch quantitative Bestimmung der intrazellulären Partikel zeigen konnte. Auch werden sowohl die Mutante als auch das AAV2 effizient in die perinukleäre Region transportiert. Da der intrazelluläre Transport von AAV innerhalb von Endosomen erfolgt und späte Endosomen in der perinuklären Region zu detektieren sind, könnte die Phospholipaseaktivität an der Freisetzung der viralen Partikel aus den Endosomen und/oder am Kerneintritt beteiligt sein. Meine Ergebnisse sprachen gegen letztere Hypothese. Dagegen konnte ich zeigen, dass die Inhibierung des proteasomalen Abbaus sowie wie Verwendung der endoosmolytischen Aktivität des Adenovirus die Transduktionseffizienz der Mutante deutlich steigerte. Daraus lässt sich ableiten, dass die Mutante innerhalb von Endosomen zurückgehalten wird und dass die PLA2 Aktivität für die Freisetzung von AAV aus den Endosomen benötigt wird

Development of a microstent system for minimally invasive glaucoma surgery

Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide. An increased intraocular pressure (IOP) is known as major risk factor. Currently, drainage devices that are implanted by means of minimally invasive glaucoma surgery (MIGS) represent a promising approach for IOP low-ering. Commercially available devices for MIGS suffer from unregulated drainage involving ocular hypotony. Further-more, long term drainage capability of current devices is limited by fibrotic encapsulation processes. Therefore, our group focusses on the development of a valved drug-eluting microstent for MIGS. Within the current work, we developed two alternative injector devices for minimally invasive mi-crostent implantation. Both injector devices were based on a cannula in which the microstent is loaded and a mandrel inside the cannula. Injector device A is designed to push the microstent out of the cannula and injector device B is de-signed to withdraw the cannula above the microstent. Manu-facturing of injector devices was conducted using rapid prototyping. Simplified polymeric microstents were manu-factured from polycarbonate based silicone elastomer. Simulated use was performed in a silicone eye model. The presented injector devices were suitable for minimally in-vasive ab interno microstent implantation into suprachoroidal space. Ongoing miniaturization of the microstent system will allow the use of a 22 G cannula in future ex vivo experiments