Asma Kallus Kültürlerinde trans-Resveratrol Üretiminin Uyarılması Üzerine Kallus Yaşı, UV Işını Uygulama ve İnkübasyon Sürelerinin Etkisi

Bu çalışmada, Kalecik karası Klon 12 Vitis vinifera L üzüm çeşidine ait kallus kültürlerinde, transresveratrol üretiminin uyarılması üzerine kallus yaşı, ultraviyole UV ışını uygulama ve inkübasyon süresinin etkisi incelenmiştir. Kallus eldesi için serada yetişen bir yaşlı asmalardan alınan yaprak parçaları ~1 cm2 , %2 sakkaroz, % 0.8 agar, 1.0 µM BAP 6-benzilaminopürin ve 0.1 µM 2, 4-D 2, 4- diklorofenosi-asetik asit eklenmiş Gamborg B-5 ortamında kültüre alınmıştır. İkinci alt kültürden sonra, 12 ve 15 gün yaşlı kalluslara, 10 cm uzaklıktan 10 ve 15 dakika süreyle 254 nm dalga boyuna sahip UV ışını uygulanmıştır.Trans-resveratrol üretiminin belirlenmesi amacıyla, Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi HPLC yönteminden yararlanılmış, ölçümler 0., 24., 48. ve 72. saatlerde yapılmıştır. Trans-resveratrol konsantrasyonu kontrol kalluslarında, 0.560.96 µg/g fw arasında değişmiştir.En yüksek trans-resveratrol üretimi, 10 dakika UV ışını uygulaması yapılmış 12 ve 15 gün yaşlı kalluslarda 48. saat ölçümlerinde elde edilmiştir 2.42 µg/g fw . Kontrol ve uygulamalarda elde edilen en yüksek trans-resveratrol derişimleri dikkate alındığında UV ışını uygulamasının Kalecik Karası’nda trans-resveratrol birikimini uyardığı ve yaklaşık 2.5 kat artış sağladığı belirlenmişti

Chlorella vulgaris biomass enriched by biosorption of polyphenols

Cell walls of microalgae are variable and contain non-specific domains where different molecules can bind. The enrichment of microalgal biomass with nutrients through adsorption can be an interesting process for the food and feed industry. In this study, naturally occurring polyphenols ((+)-catechin, ()-epicatechin, quercetin, rutin and xanthohumol) were adsorbed onto nonliving cells of freshwater microalgae Chlorella vulgaris. The essential adsorption parameters such as biomass dose and contact time were examined and the adsorption was quantified with Langmuir, Sips and DubininRadushkevich adsorption isotherms. The evaluation of isotherms proved the highest affinity towards Chlorella vulgaris biomass for xanthohumol and quercetin. The biosorption mechanism of Chlorella vulgaris biomass was well described by a pseudo second order kinetic model, with a high regression coefficient. The polyphenol-enriched microalgal biomass was also evaluated for its antioxidant activity. The highest antioxidant activity was detected in the case of biomass enriched with quercetin (77.5% of decolorized DPPH).The financial support by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic through grant MSM6046137305 is gratefully acknowledged. Cristina Quintelas is thankful to Fundacao para a Ciencia e a Tecnologia (FCT, Portugal) for funding the CEB researcher unit at the University of Minho and thanks the Project "BioInd - Biotechnology and Bioengineering for improved Industrial and Agro-Food processes, REF. NORTE-07-0124-FEDER-000028" co-funded by the Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 - O Novo Norte), QREN and FEDER

Resveratrol and tumor microenvironment: mechanistic basis and therapeutic targets

© 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. Resveratrol (3,40,5 trihydroxystilbene) is a naturally occurring non-flavonoid polyphenol. It has various pharmacological effects including antioxidant, anti-diabetic, anti-inflammatory and anti-cancer. Many studies have given special attention to different aspects of resveratrol anti-cancer properties and proved its high efficiency in targeting multiple cancer hallmarks. Tumor microenvironment has a critical role in cancer development and progression. Tumor cells coordinate with a cast of normal cells to aid the malignant behavior of cancer. Many cancer supporting players were detected in tumor microenvironment. These players include blood and lymphatic vessels, infiltrating immune cells, stromal fibroblasts and the extracellular matrix. Targeting tumor microenvironment components is a promising strategy in cancer therapy. Resveratrol with its diverse biological activities has the capacity to target tumor microenvironment by manipulating the function of many components surrounding cancer cells. This review summarizes the targets of resveratrol in tumor microenvironment and the mechanisms involved in this targeting. Studies discussed in this review will participate in building a solid ground for researchers to have more insight into the mechanism of action of resveratrol in tumor microenvironment

Using Knowledge of the Polyphenolic Profile of Croatian Wines for Marketing Purposes

Umjerena i redovita konzumacija vina povezana je s brojnim blagotvornim učincima vina na zdravlje čovjeka. Ti učinci su povezani s polifenolnim supstancijama iz vina koje imaju najsnažniji utjecaj na bolesti srca i krvnih žila. Polifenolne sastavnice vina su također zaslužne za antikancerogeno, neuroprotektivno i antidijabetičko djelovanje. Na temelju toga vino se, posebice crno, može smatrati funkcionalnom hranom koja ima i dokazano farmakološko djelovanje. Hrvatska obiluje vinorodnim područjima i kvalitetnim vinima, ali su te činjenice slabo iskorištene u marketinške svrhe. Crna vina iz Srednje i Južne Dalmacije imaju najveći sadržaj polifenola, što se pripisuje povoljnijim klimatskim uvjetima koji uvelike utječu na formiranje tih tvari u grožđu tijekom zriobe. Međutim, neka vina iz kontinentalne Hrvatske svojom kvalitetom ne zaostaju za dalmatinskim vinima. Naša se vina moraju istaknuti iz mase stranih, uvoznih vina koja su mahom jeftinija, ali ne nužno i slabije kvalitete od hrvatskih te privući kupca i u našoj zemlji, a posebice u inozemstvu. Navedene činjenice treba maksimalno iskoristiti u strategiji prodaje, distribucije, promocije i marketinga hrvatskih vina.Regular moderate wine consumption has been associated with numerous health benefits. These effects are associated with polyphenolic compounds found in wine that have the strongest influence on cardiovascular diseases. Polyphenols also exhibit anti-cancerogenic, neuroprotective, and anti-diabetic effects. Hence, wine, and especially red wine, may be considered as functional food with confirmed pharmacological effects. Croatia abounds with vineyards and high-quality wine, but these facts are insufficiently used in marketing. Red wine sorts from Central and South Dalmatia have the highest polyphenolic content that is attributed to favourable climatic conditions, which greatly determine the formation of these compounds during the ripening of grapes. Several wine sorts from continental Croatia, owing to their quality, are, however, not at all inferior to Dalmatian wine. Hence, our wine should be propounded from the bulk of cheap and lower-quality imported wine, as well as attract customers both at home and abroad. Given facts should be maximally used in the strategy of the selling, distribution, promotion and marketing of Croatian wine

Cytotoxicity of peroxynitrite and nitric oxide induced oxidative stress on 3T3 fibroblast cell line

In the present study, the oxidative and cytotoxic effects of two biologically important molecules, NO and ONOŌ have been studied in 3T3 Fibroblast cell line. NO is a key molecule in many physiological pathways, but also its reactivity gives it the potential to cause considerable damage to cells and tissues. NȮ reacts rapidly with superoxide anion (O².̄) to form ONOŌ which is a powerful oxidant. Cell morphology and viability studies showed that both NO. and ONOŌ caused significant loss of viability in 3T3 fibroblast cell line. Intracellular ROS production has been monitored by a fluorescent probe, DCFH-DA. When cells were treated with of NO, a significant increase in fluorescence intensity has been observed when compared to the control cells and this was supported with flourometric analysis results. Similar results have been observed when cells were incubated with ONOŌ at the same concentration range. To further studies, cells were stained by a fluorescent probe Hoechst 33342 (HO) to identify apoptotic cells; both NO and ONOŌ induced apoptosis. In molecular studies, cells were incubated with the oxidant molecules, NȮ and ONOŌ for different time periods and at all relevant doses. In all conditions, DNA remained intact; indicating that cytotoxic effect of NO and ONOŌ were merely due to a mechanism other than apoptosis. This phenomena requires further mechanistic studies. A potential antioxidant molecule, Catechin has been studied as a preventive molecule against cytotoxicity. In chemical model system Catechin was left to react with ONOŌ and FT-IR and NMR analysis of the end product gave us preliminary information about its structure. In cellular studies, the effect of Catechin on NO. and ONOŌ induced cytotoxicity was investigated. The optimum determined conditions for preventive effect of Catechin were 5 mM of Catechin for 50 mM of NO. and 200 mM of ONOŌ. These results were discussed in the light of ROS induced cytotoxicity in cellular signaling mechanisms

Dietary Manipulation for Therapeutic Effect in Prostate Cancer

Given that there is a wealth of literature on the potential effect of a wide variety of phytochemicals on the growth of prostate cancer cells, we have limited our discussion to arguably four of the most important: isoflavones, lycopene, resveratrol, and curcumin. The focus of this review is on the clinical pharmacology of these compounds, as there are already an extensive number of reviews in the literature on all of these compounds for various cancers, including our previous review of isoflavones in prostate cancer (de Souza et al., 2009). Here, we use the loose term “phytochemicals” to describe this group of plant–based compounds with biological activity in vitro, for simplicity. Like other phytochemicals, isoflavones, lycopene, resveratrol and curcumin have a wide variety of potential mechanisms of action in many different cancer cell lines. Many of these biological effects involve key components of signal transduction pathways within cancer cells, but in this review, we will be focusing on studies specifically in prostate cancer

Phenols, volatiles and sensory properties of primitivo wines from the "Gioia Del Colle" PDO area

The aim of this study was to characterise the phenol, anthocyanin, volatile and sensory profiles of Primitivo wines. The wines were produced in three wineries located in the Gioia del Colle PDO (Protected Designation of Origin) area (Southern Italy - Apulia Region). The grapes came from three vineyards of different ages and were grown according to different training systems. The winemaking techniques applied also differed in some technological variables. The results obtained showed that all wines had a high alcohol content (15 to 16% v/v) and were rich in total phenols and proanthocyanidins. The anthocyanin profile was characterised by the prevalence of non-acylated forms, of which malvidin-3-O-monoglucoside accounted for 62 to 67% of the total anthocyanin, followed by the coumarate, acetate and caffeate forms. The volatile fraction was constituted mainly alcohols and esters, the latter having concentrations above the odour threshold. From a sensory point of view, all wines were judged positively, and presented high olfactory and gustatory persistence. The main odour attributes found were soft fruits, cherry and cloves

Agentes antioxidantes no mosto da uva Niágara Branca: influência no teor de polifenóis e na atividade da polifenoloxidase

TCC (graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Agrárias. Ciência e Tecnologia de Alimentos.A principal forma de prevenir as reações de oxidação no mosto e no vinho branco é a adição de sulfito em diferentes etapas do processo de vinificação. No entanto, a utilização de altas concentrações deste composto apresenta relação direta com o surgimento de aromas desagradáveis nos vinhos, assim como pode acarretar em riscos à saúde. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da adição de diferentes agentes antioxidantes no mosto da uva Niágara Branca quanto à inibição do escurecimento e da atividade da polifenoloxidase assim como o impacto na composição fenólica e atividade antioxidante. Para obter o mosto, a uva foi esmagada manualmente, em seguida o mosto foi centrifugado a 4.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante, denominado extrato bruto, foi utilizado para as análises. Nesta etapa ocorreu a adição dos agentes antioxidantes: metabissulfito de potássio, ácido ascórbico e glutationa, de forma isolada e combinada e um mosto não foi adicionado de agente (mosto controle). Após a realização dos tratamentos, os mostos foram analisados quanto à atividade da polifenoloxidase, índice de escurecimento, polifenóis totais, orto-difenóis e atividade antioxidante. Para determinar a atividade da polifenoloxidase, primeiramente foram avaliados os fatores como temperatura e pH ideal da enzima no extrato bruto. A atividade ótima da enzima foi no pH de 6,5 e na temperatura de 25 ºC. Os resultados demostraram que todos os mostos adicionados dos agentes antioxidantes apresentaram efetivo controle da atividade da polifenoloxidase e índice de escurecimento enzimático. Dentre os agentes adicionados, pode-se destacar o mosto adicionado de 3 agentes combinados (metabissulfito de potássio, ácido ascórbico e glutationa) que apresentou forte redução da ação da atividade da polifenoloxidase e do índice de escurecimento do mosto. Também, esta mesma amostra apresentou o maior teor de polifenóis totais e capacidade antioxidante. A partir dos resultados obtidos pode-se observar que a redução da concentração do metabissulfito de potássio no mosto é possível quando este for associado com outros agentes antioxidantes, com efetivo efeito no controle das reações de oxidação enzimática.The main way to prevent oxidation in must and white wine is the addition of sulfite at different stages of the winemaking process. However, the use of high concentrations of this compound is directly related to the emergence of unpleasant aromas in wines, as well as health risks. Therefore, the aim of this study was to evaluate the influence of the addition of different antioxidant agents in the Niagara grape must on the inhibition of browning and activity of polyphenol oxidase as well as the impact on phenolic composition and antioxidant activity. To obtain the must, the grape was crushed manually and then centrifuged at 4,000 rpm for 10 minutes. The supernatant, named crude extract, was used for the analyzes. At this stage, the antioxidant agents were added: potassium metabisulphite, ascorbic acid and glutathione, in isolation and in combination, and as a control was maintained the musts without addition of agent. After the treatments, the musts were analyzed for polyphenol oxidase activity, browning index, total polyphenols, ortho-diphenols and antioxidant activity. To determine the activity of polyphenol oxidase, firstly factors such as temperature and ideal pH of the enzyme in the crude extract were evaluated. The optimal activity of the enzyme was at pH 6.5 and at 25 ºC. The results showed that all musts added from antioxidant agents showed effective control of polyphenol oxidase activity and enzymatic browning index. Among the added agents, it can highlight the added must of 3 combined agents (potassium metabisulphite, ascorbic acid and glutathione) that showed strong reduction of the action of the polyphenol oxidase activity and the browning index of the must. Also, this same sample had the highest total polyphenol content and antioxidant capacity. From results, it was observed that the reduction of the potassium metabisulphite concentration in the must is possible when it is associated with other antioxidant agents, with effective effect in the control of the enzymatic oxidation reactions

Metabolic characterization of grapevine leaves: first clues towards biomarkers discovery

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016A videira (Vitis vinifera L.) é atualmente a árvore de fruto mais cultivada em todo o mundo devido à sua importância económica na indústria vinícola. Em 2014, a área mundial coberta por vinhas para produção de uvas, passas de uva, vinho e outros produtos foi de 7375 kha (Relatório anual da Organização internacional de vinha e vinho). A União Europeia é líder mundial na produção de vinho, tendo quase metade da área vinícola total (Relatório Anual e Estatísticas da produção vinícola - Rede Global de Informação Agrícola, 2014). Em relação à produção de vinho, França, Itália, Espanha e Argentina são atualmente os cinco países com maior produção. Por outro lado, a China, Turquia, Irão e Índia são os maiores produtores mundiais de uvas frescas para consumo. Portugal é o décimo produtor de vinho a nível mundial e o quinto na Europa, tendo este sector uma elevada importância estratégica para a economia do País, representando cerca de 890 milhões € em exportações só em 2013 (dados de Global Agricultural Information Network, 2013). De todos os produtos vitícolas, e apesar das uvas e do vinho serem maioritariamente os mais comercializados, alguns países como a Turquia, Arábia Saudita, Grécia, Bulgária, Roménia e Vietnam estão a cultivar algumas espécies de videira especificamente para a produção de folhas para consumo na alimentação. Em Portugal, as folhas de algumas cultivares de videira começaram já a ser analisadas para a inclusão na dieta, devido ao seu conteúdo antioxidante e compostos fenólicos. Os seus benefícios para a saúde têm sido cada vez mais estudados, tendo-se demonstrado que este produto pode ser utilizado, por exemplo, para o tratamento de dores crónicas, processos inflamatórios e pressão arterial elevada. Estas propriedades, o valor nutricional, o sabor e a qualidade são devidos a uma diversidade de compostos secundários como compostos fenólicos, ácidos orgânicos, lípidos e glúcidos. As cultivares de Vitis vinifera normalmente utilizadas na produção de vinho são suscetíveis ao míldio, uma doença extremamente destrutiva causada pelo fungo Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni. Esta doença foi acidentalmente introduzida na Europa durante o século XIX e continua a ser uma das mais destrutivas doenças que afetam as vinhas neste continente. Estudos realizados indicam que, em interações compatíveis, este fungo poderá controlar o metabolismo das células hospedeiras, permitindo assim a sua sobrevivência e proliferação, promovendo a destruição completa das vinhas e consequentemente significantes perdas económicas. Em 2014, a colheita de uva em Portugal diminuiu cerca de 5.7%, devido a más condições meteorológicas na região Norte e devido ao aparecimento de míldio nas regiões do Centro e Sul, que subsistiu apesar dos tratamentos com fungicidas aplicados. Algumas estratégias têm sido implementadas de forma a evitar a ameaça causada pelo P. viticola, incluindo o uso intensivo de fungicidas e fitoquímicos. Estas abordagens não são eficazes, nem compatíveis com um desenvolvimento sustentável, nem seguras para a saúde pública. Para além disto, as folhas podem ser incluídas na alimentação e a sua exposição a estes produtos químicos torna a sua descontaminação e certificação para a comercialização ainda mais difícil. Algumas espécies Americanas e Asiáticas de Vitis são resistentes ao míldio, pelo que uma possível alternativa na prevenção da infeção pelo míldio é a criação de alguns híbridos intra-específicos. Esta última abordagem é claramente mais eficaz e sustentável, particularmente se for acoplada à seleção de características com interesse económico de cultivares de videira locais, permitindo a preservação das propriedades desejadas e únicas do vinho local. No entanto, um programa bem-sucedido de reprodução de plantas melhoradas com características de resistência ao míldio requer, não só uma compreensão dos mecanismos de resistência inata de cultivares contra os fungos, mas também a identificação de biomarcadores de resistência. De entre estes, os biomarcadores metabólicos podem revelar-se particularmente úteis. Inúmeros trabalhos científicos nas áreas de transcritómica, proteómica e metabolómica foram publicados na última década com abordagens para a caracterização de resistência ao míldio. Uma análise metabólica dos diversos produtos da videira é de elevada importância visto que as plantas contêm um metaboloma único que varia com as condições ambientais, o desenvolvimento da planta e infeções de patogénicas. Em relação às folhas de videira, visto que é o primeiro órgão que o P. vitícola infecta, estas podem possuir na sua composição biomarcadores de resistência ou suscetibilidade contra este patogénio. Normalmente, um estudo metabólico é realizado recorrendo a técnicas como a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrometria de Massa (MS) ou à combinação destas técnicas a processos de separação cromatográficos como a Cromatografia Gasosa (CG) ou Líquida (LC). Contudo, os limites de deteção por RMN são baixos e apesar da combinação de MS com CG e LC possibilitar a deteção de um elevado número de compostos, os processos cromatográficos demoram muito tempo e normalmente necessitam de vários passos de limpeza do equipamento. Uma solução será a utilização de Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance acoplado a um espectrómetro de massa (FT-ICR-MS) visto que é um equipamento que não só combina a elevada resolução com a elevada exatidão de massa como também permite uma rápida e fácil aquisição de resultados. Esta dissertação teve como foco principal a caracterização metabólica de folhas de Vitis vinifera cultivar Pinor noir. O primeiro objetivo foi estabelecer um protocolo de extração de metabolitos compatível com uma análise de espectrometria de massa com elevada resolução (Capítulo II). Para isso, foi desenvolvido um protocolo de extração de metabolitos com uma mistura de solventes dando origem a quatro frações (metanólica, aquosa, orgânica e acetonitrilo) que foram analisadas por FT-ICR-MS. A análise destas quatro frações foi efectuada em modo positivo e negativo, permitindo identificar no total, respetivamente, 634 e 133 massas únicas. Após o estabelecimento de um protocolo de extração otimizado, o segundo objetivo foi a análise do metaboloma das folhas de videira da cultivar Pinot noir e a importância destes compostos na saúde humana (Capítulo III). Os compostos identificados foram anotados e divididos em oito classes metabólicas principais (lípidos, glúcidos, ácidos nucleicos, compostos fitoquímicos, compostos heterocíclicos, ácidos orgânicos e derivados, benzenóides e outros) e estas posteriormente em classes secundárias e terciárias quando necessário. Do metaboloma anotado, a classe mais representada neste estudo foi a classe dos lípidos com 67%, seguida dos compostos fenólicos (13%), ácidos orgânicos (7%) e glúcidos (3%). É importante salientar que na classe dos compostos fenólicos, foi detetada pela primeira vez em folhas da cultivar Pinot noir uma antocianina acetilada. Para além disso, foi ainda realizada uma análise das vias metabólicas utilizando uma ferramenta online pública, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), de modo a perceber a cobertura dos nossos resultados e identificar compostos importantes. Finalmente, o terceiro objetivo foi comparar a nível metabólico dez espécies e cultivares, resistentes e suscetíveis ao míldio, identificar compostos presentes apenas num grupo de videiras resistentes ou suscetíveis, permitindo desta forma diferenciar os dois grupos e integrar essa informação metabólica com a quantificação de transcritos, de forma a definir marcadores de resistência (Capítulo IV). No total foram identificados nove compostos presentes apenas no grupo de videiras resistentes ou suscetíveis ao míldio. Foram também incluídos na análise sete compostos descritos na literatura como possíveis marcadores de resistência ou com padrões de acumulação em diferentes videiras. A quantificação da expressão de genes que codificam para enzimas de síntese ou degradação para estes compostos foram analisados por reação de polimerase de cadeia em tempo real (qPCR). Para este trabalho a nossa referência e o principal modelo de estudo foi a cultivar Pinot noir, sendo a expressão dos genes desta cultivar considerada como controlo para todos os outros. Para além disto, como a expressão de genes de interesse tem de ser normalizada com genes de referência, a estabilidade de onze genes foi avaliada e os três genes mais estáveis foram considerados utilizados para normalizar os dados. Cada capítulo desta tese foi escrito como um artigo científico e cada possui o seu próprio resumo, introdução, materiais e métodos, resultados e discussão, conclusão, agradecimentos e referências bibliográficas. Esta abordagem de biologia de sistemas é um ponto de partida para elucidar quais as bases moleculares inerentes à resistência e suscetibilidade das videiras e, quem sabe, a longo prazo, utilizar estes metabolitos associados à resistência no desenvolvimento de ensaios de biomarcadores para utilização em futuros programas de melhoramento e análise de linhagens.Grapevine (Vitis vinifera L.) is the most important fruit crop in the world due to its numerous food products, namely fresh and dried table grapes, wine grapes, leaves and intermediate products. Traditional premium cultivars of wine and table grapes are highly susceptible to various diseases, particularly to downy mildew. Grapevine downy mildew is caused by the biotrophic oomycete Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni and is one of the most destructive diseases in Vitis vinifera. In Europe, disease management became one of the main tasks for viticulture, being the current strategy, for downy mildew disease control, the massive use of fungicides and pesticides in each growing season. This practice has several associated problems, from the environmental impact to the economical level, and even in human health. The alternative approach is the introduction of resistant grapevine varieties, clearly most effective and sustainable, particularly if coupled to the selection of desirable traits from local grapevine cultivars. However, a successful breeding program of grape plants with increased resistance traits against downy mildew requires, not only an understanding of the innate resistance mechanisms of cultivars against fungi, but also the identification of biomarkers of resistance (or susceptibility). Among these, metabolic biomarkers may prove particularly useful, not only because they can be determined in a high throughput way but, above all, because metabolites provide accurate metabolic state definition. The first part of this thesis (Chapter II) focuses on the establishment of an appropriate metabolite extraction protocol for Vitis vinifera cultivar Pinot noir grapevine leaves, compatible with high resolution mass spectrometry. Different extraction protocols with different solvent mixtures were tested and the metabolic analysis was performed using direct infusion Fourier-transform ion cyclotron-resonance mass spectrometry (DI-FTICR-MS). A mixture of methanol/water/chloroform was the best extraction mixture, allowing a higher metabolite extraction yield, reproducibility and metabolome cover. Four fractions were obtained (methanol, water, organic and acetonitrile), which were analysed by FT-ICR-MS, using electrospray ionization (ESI) in both ionization modes (positive [ESI+] and negative [ESI-]). In total we identified 634 and 144 unique masses by, respectively, ESI+ and ESI-. The metabolic coverage of the fractions was compared for ESI+ and ESI- and only 59 masses were common in both ionization modes. This extraction protocol allowed the extraction of polar and non-polar compounds, covering all major classes found in plants and increasing metabolome coverage. After the establishment of an optimized and efficient extraction protocol, metabolite annotation of grapevine leaves from cultivar Pinot noir was performed, not only with the purpose of obtaining the most comprehensive metabolite analysis in Vitis vinifera, but also for metabolite characterization associated with leaves’ high nutritional value, taste and health benefits (Chapter III). Indeed, grapevine leaves are considered a healthy food due to their human health benefits, mainly for their content in a wide range of phenolic compounds. The metabolome of Vitis vinifera cultivar Pinot noir grapevine leaves was annotated and the identified compounds were classified into eight major metabolic classes (lipids, carbohydrates and conjugates, nucleic acids, phytochemical compounds, heterocyclic compounds, organic acids and derivatives, benzenoids and others), secondary and if needed into third metabolic classes. Lipids were the most represented class with 67% of the metabolome identified followed by phytochemical compounds (13%), organic acids (7%) and carbohydrates (3%). Each of these classes was further associated to human health benefits, highlighting the benefits of grapevine leaves consumption. Noteworthy, thirteen mostly used pesticides were also found in grapevine leaves, being therefore essential the development of new methodologies for quality assessment and safe commercialisation. The comprehensive metabolite analysis from Vitis vinifera leaves was the starting point for the identification of biomarkers of resistance or susceptibility against the downy mildew. In order to identify compounds present only in susceptible or in resistant grapevines, ten Vitis vinifera species and cultivars, were compared at the metabolite level (Chapter IV). The metabolite extraction protocol previously optimized was used, but only the methanol fraction (which contained some of the most relevant compounds involved in defence mechanisms) was analysed by DI-FTICR-MS using ESI+ and ESI-. A first analysis revealed nine masses distinctly identified (6 in ESI- and 3 in ESI+) that might be resistant- or susceptible-specific. The goal was to integrate this information with transcript quantification. Hence, two of these compounds were selected, together with seven other reported in literature as involved in defence mechanisms and their metabolic pathways were identified. The expression profile of several biosynthesis and/or degradation enzymes coding genes was performed by Real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR). To have success in this analysis, qPCR studies require as internal controls one or more reference genes, for all the samples analysed. Hence, eleven possible reference genes were tested and normalization of the qPCR results from the enzyme coding genes was made using the three most stable reference genes. This systems biology approach, based on the integration of the metabolic profiling and transcriptomics will enlighten the molecular basis of the differences between susceptible and resistant cultivars. Each chapter was written as a scientific article and has its own abstract, introduction, materials and methods, results and discussion, conclusion, acknowledgements and references. This thesis is a starting point for, in the long run, use these resistance-associated metabolites in the development of streamlined biomarker assays to assist future breeding programs and introgression line analysis