Charakterisierung der molekularen Determinanten zur hochaffinen Bindung der kompatiblen Soluten Glycin Betain, Prolin Betain, Ectoin und Hydroxyectoin durch Substratbindeproteine von bakteriellen ABC-Transportern

Die Akkumulation von kompatiblen Soluten ist ein weit verbreiteter Schutzmechanismus gegen variierende Umweltbedingungen und wird in vielen Spezies der Bacteria und Archaea verwendet. Das einige kompatible Solute nicht nur osmoprotektive Wirkung haben, sondern generell Protein-stabilisierende Substanzen sind, ist durch in vitro Experimente belegt. Der Protein-stabilisierende Effekt wird in dem „preferential exclusion model“ beschrieben und beruht auf dem thermodynamisch begründeten, bevorzugten Ausschluß der Solute von der Oberfläche der Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurden die Substratbindeproteine zweier hochaffiner ABC-Transporter für die kompatiblen Solute Glycin Betain und Prolin Betain auf molekularer Ebene untersucht, um die Grundlagen zur Bindung von „bevorzugt ausgeschlossenen Soluten“ zu beschreiben. Dazu wurden die beiden hochaufgelösten Kristallstrukturen der Substratbindeproteine aus dem ProU-System von E. coli (EcProX, 1,6 Å) und dem ProU-System von A. fulgidus (AfProX 1,9 Å) verwendet. In EcProX wird das quartäre Amin des gebundenen Glycin Betains durch eine Box von drei Tryptophanen koordiniert (Trp-65, Trp-140 und Trp-188), die Carboxylgruppe des Glycin Betains wird durch H-Brücken stabilisiert. In einer Mutagenestudie konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Kation-pi-Interaktionen eine Haupt-Determinante in der Bindung von Glycin Betain sind. Es konnte gezeigt werden, dass neben Tryptophan auch Phenylalanin und Tyrosin zu starken Interaktionen mit dem Substrat fähig sind. Die Mutagenesestudie demonstrierte eine unterschiedlich starke Beteiligung der Tryptophane an der Substratbindung. Trp-188 ist dabei essentiell für die Bindung von Glycin Betain, Trp-140 zeigte die geringste Beteiligung. Trp-188 benötigt die Tryptophane Trp-140 und Trp-65 aber zur Stabilisierung des quartären Amins von Glycin Betain in der Bindetasche. Das AfProX Protein zeigt in Affinitätsmessungen eine besonders hohe Affinität zu Glycin Betain und Prolin Betain. Verglichen mit dem EcProX Protein ist die KD von AfProX zu Glycin Betain bei 50°C (0,01 µM) um den Faktor 100 niedriger als die des EcProX Proteins bei Raumtemperatur (KD=1µM) und um den Faktor 1000 niedriger verglichen zum OpuAC Protein (KD=17 µM), einem Glycin Betain und Prolin Betain bindenden Protein aus B. subtilis. In der Kristallstruktur von AfProX zeigte sich eine weitere Konstellation einer aromatischen Bindetasche. Das quartäre Amin wird dort von den vier Tyrosinen Tyr-63, Tyr-111, Tyr-190 und Tyr-214 (Tyrosin-Gürtel) und einem Aspartat koordiniert, die Carboxylgruppe wird durch Salz- und H-Brücken stabilisiert. Eine Mutagenesestudie zeigte auch hier die wichtige Beteiligung von Kation-pi-Interaktionen an der hochaffinen Bindung dieser kompatiblen Solute. Dabei ist die besondere Architektur des Tyrosin-Gürtels, zusammen mit den Carboxylgruppen-stabilisierenden Aminosäuren, essentiell für die hohe Bindeaffinität. Je nach Position des Tyrosins kann der Austausch eines Tyrosins gegen ein Alanin das Absinken der Bindekonstante auf einen Wert, vergleichbar zu dem des EcProX- oder des BsOpuAC-Proteins, oder niedriger bewirken. Ein Austausch von zwei Tyrosinen gegen Alanin bedeutet immer einen kompletten Verlust der Bindeaffinität. Datenbankanalysen der Aminosäuresequenzen von EcProX, AfProX und BsOpuAC zeigten eine weite Verbreitung der konservierten Bindemotive der Proteine und im Falle von BsOpuAC eine besonders starke Konservierung der bindungsrelevanen Tryptophane („Trp-Prisma“) sowie einen Domänentausch im Vergleich zu anderen Glycin Betain Bindeproteinen. Die Entdeckung eines Substratbindeprotein-abhängigen ABC-Transporters (Ehu) für Ectoin und Hydroxyectoin in S. meliloti erlaubte die Analyse der Ectoin-Bindung durch ein Substratbindeprotein. Nach der Überproduktion, Reinigung und Charakterisierung des hochaffinen Ectoin-Bindeproteins (EhuB) und dessen Kristallistation mit gebundenem Ectoin (und Hydroxyectoin) zeigte die Struktur (Auflösung 2,1 Å) in der Substratbindestelle eine aromatische Box aus zwei Phenylalaninen und einem Tyrosin, welche die delokalisierte positive Ladung des Moleküls binden. Der Pyrimidinring und die Carboxylgruppe des Ectoins werden durch Salz- und H-Brücken stabilisiert. Kation-pi-Interaktionen sind eine Hauptdeterminate in der hochaffinen Bindung von Glycin Betain und Prolin Betain, aber auch von Ectoin und Hydroxyectoin und finden eine weite Verbreitung in den Bacteria und Archaea

Charakterisierung der molekularen Determinanten zur hochaffinen Bindung der kompatiblen Soluten Glycin Betain, Prolin Betain, Ectoin und Hydroxyectoin durch Substratbindeproteine von bakteriellen ABC-Transportern

Die Akkumulation von kompatiblen Soluten ist ein weit verbreiteter Schutzmechanismus gegen variierende Umweltbedingungen und wird in vielen Spezies der Bacteria und Archaea verwendet. Das einige kompatible Solute nicht nur osmoprotektive Wirkung haben, sondern generell Protein-stabilisierende Substanzen sind, ist durch in vitro Experimente belegt. Der Protein-stabilisierende Effekt wird in dem „preferential exclusion model“ beschrieben und beruht auf dem thermodynamisch begründeten, bevorzugten Ausschluß der Solute von der Oberfläche der Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurden die Substratbindeproteine zweier hochaffiner ABC-Transporter für die kompatiblen Solute Glycin Betain und Prolin Betain auf molekularer Ebene untersucht, um die Grundlagen zur Bindung von „bevorzugt ausgeschlossenen Soluten“ zu beschreiben. Dazu wurden die beiden hochaufgelösten Kristallstrukturen der Substratbindeproteine aus dem ProU-System von E. coli (EcProX, 1,6 Å) und dem ProU-System von A. fulgidus (AfProX 1,9 Å) verwendet. In EcProX wird das quartäre Amin des gebundenen Glycin Betains durch eine Box von drei Tryptophanen koordiniert (Trp-65, Trp-140 und Trp-188), die Carboxylgruppe des Glycin Betains wird durch H-Brücken stabilisiert. In einer Mutagenestudie konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Kation-pi-Interaktionen eine Haupt-Determinante in der Bindung von Glycin Betain sind. Es konnte gezeigt werden, dass neben Tryptophan auch Phenylalanin und Tyrosin zu starken Interaktionen mit dem Substrat fähig sind. Die Mutagenesestudie demonstrierte eine unterschiedlich starke Beteiligung der Tryptophane an der Substratbindung. Trp-188 ist dabei essentiell für die Bindung von Glycin Betain, Trp-140 zeigte die geringste Beteiligung. Trp-188 benötigt die Tryptophane Trp-140 und Trp-65 aber zur Stabilisierung des quartären Amins von Glycin Betain in der Bindetasche. Das AfProX Protein zeigt in Affinitätsmessungen eine besonders hohe Affinität zu Glycin Betain und Prolin Betain. Verglichen mit dem EcProX Protein ist die KD von AfProX zu Glycin Betain bei 50°C (0,01 µM) um den Faktor 100 niedriger als die des EcProX Proteins bei Raumtemperatur (KD=1µM) und um den Faktor 1000 niedriger verglichen zum OpuAC Protein (KD=17 µM), einem Glycin Betain und Prolin Betain bindenden Protein aus B. subtilis. In der Kristallstruktur von AfProX zeigte sich eine weitere Konstellation einer aromatischen Bindetasche. Das quartäre Amin wird dort von den vier Tyrosinen Tyr-63, Tyr-111, Tyr-190 und Tyr-214 (Tyrosin-Gürtel) und einem Aspartat koordiniert, die Carboxylgruppe wird durch Salz- und H-Brücken stabilisiert. Eine Mutagenesestudie zeigte auch hier die wichtige Beteiligung von Kation-pi-Interaktionen an der hochaffinen Bindung dieser kompatiblen Solute. Dabei ist die besondere Architektur des Tyrosin-Gürtels, zusammen mit den Carboxylgruppen-stabilisierenden Aminosäuren, essentiell für die hohe Bindeaffinität. Je nach Position des Tyrosins kann der Austausch eines Tyrosins gegen ein Alanin das Absinken der Bindekonstante auf einen Wert, vergleichbar zu dem des EcProX- oder des BsOpuAC-Proteins, oder niedriger bewirken. Ein Austausch von zwei Tyrosinen gegen Alanin bedeutet immer einen kompletten Verlust der Bindeaffinität. Datenbankanalysen der Aminosäuresequenzen von EcProX, AfProX und BsOpuAC zeigten eine weite Verbreitung der konservierten Bindemotive der Proteine und im Falle von BsOpuAC eine besonders starke Konservierung der bindungsrelevanen Tryptophane („Trp-Prisma“) sowie einen Domänentausch im Vergleich zu anderen Glycin Betain Bindeproteinen. Die Entdeckung eines Substratbindeprotein-abhängigen ABC-Transporters (Ehu) für Ectoin und Hydroxyectoin in S. meliloti erlaubte die Analyse der Ectoin-Bindung durch ein Substratbindeprotein. Nach der Überproduktion, Reinigung und Charakterisierung des hochaffinen Ectoin-Bindeproteins (EhuB) und dessen Kristallistation mit gebundenem Ectoin (und Hydroxyectoin) zeigte die Struktur (Auflösung 2,1 Å) in der Substratbindestelle eine aromatische Box aus zwei Phenylalaninen und einem Tyrosin, welche die delokalisierte positive Ladung des Moleküls binden. Der Pyrimidinring und die Carboxylgruppe des Ectoins werden durch Salz- und H-Brücken stabilisiert. Kation-pi-Interaktionen sind eine Hauptdeterminate in der hochaffinen Bindung von Glycin Betain und Prolin Betain, aber auch von Ectoin und Hydroxyectoin und finden eine weite Verbreitung in den Bacteria und Archaea

Ectoine-Induced Proteins in Sinorhizobium meliloti Include an Ectoine ABC-Type Transporter Involved in Osmoprotection and Ectoine Catabolism

To understand the mechanisms of ectoine-induced osmoprotection in Sinorhizobium meliloti, a proteomic examination of S. meliloti cells grown in minimal medium supplemented with ectoine was undertaken. This revealed the induction of 10 proteins. The protein products of eight genes were identified by using matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry. Five of these genes, with four other genes whose products were not detected on two-dimensional gels, belong to the same gene cluster, which is localized on the pSymB megaplasmid. Four of the nine genes encode the characteristic components of an ATP-binding cassette transporter that was named ehu, for ectoine/hydroxyectoine uptake. This transporter was encoded by four genes (ehuA, ehuB, ehuC, and ehuD) that formed an operon with another gene cluster that contains five genes, named eutABCDE for ectoine utilization. On the basis of sequence homologies, eutABCDE encode enzymes with putative and hypothetical functions in ectoine catabolism. Analysis of the properties of ehuA and eutA mutants suggests that S. meliloti possesses at least one additional ectoine catabolic pathway as well as a lower-affinity transport system for ectoine and hydroxyectoine. The expression of ehuB, as determined by measurements of UidA activity, was shown to be induced by ectoine and hydroxyectoine but not by glycine betaine or by high osmolality

Crystal structure of the ligand-binding protein EhuB from Sinorhizobium meliloti reveals substrate recognition of the compatible solutes ectoine and hydroxyectoine.

International audienceIn microorganisms, members of the binding-protein-dependent ATP-binding cassette transporter superfamily constitute an important class of transport systems. Some of them are involved in osmoprotection under hyperosmotic stress by facilitating the uptake of "compatible solutes". Currently, the molecular mechanisms used by these transport systems to recognize compatible solutes are limited to transporters specific for glycine betaine and proline betaine. Therefore, this study reports a detailed analysis of the molecular principles governing substrate recognition in the Ehu system from Sinorhizobium meliloti, which is responsible for the uptake of the compatible solutes ectoine and hydroxyectoine. To contribute to a broader understanding of the molecular interactions underlying substrate specificity, our study focused on the substrate-binding protein EhuB because this protein binds the ligand selectively, delivers it to the translocation machinery in the membrane and is thought to be responsible for substrate specificity. The crystal structures of EhuB, in complex with ectoine and hydroxyectoine, were determined at a resolution of 1.9 A and 2.3 A, respectively, and allowed us to assign the structural principles of substrate recognition and binding. Based on these results, site-directed mutagenesis of amino acids involved in ligand binding was employed to address their individual contribution to complex stability. A comparison with the crystal structures of other binding proteins specific for compatible solutes revealed common principles of substrate recognition, but also important differences that might be an adaptation to the nature of the ligand and to the demands on protein affinity imposed by the environment

Crystal structures of the choline/acetylcholine substrate binding protein ChoX from Sinorhizobium meliloti in the liganded and unliganded closed states

The ATP-binding cassette transporter ChoVWX is one of several choline import systems operating in Sinorhizobium meliloti. Here fluorescence-based ligand binding assays were used to quantitate substrate binding by the periplasmic ligand-binding protein ChoX. These data confirmed that ChoX recognizes choline and acetylcholine with high and medium affinity, respectively. We also report the crystal structures of ChoX in complex with either choline or acetylcholine. These structural investigations revealed an architecture of the ChoX binding pocket and mode of substrate binding similar to that reported previously for several compatible solute-binding proteins. Additionally the ChoX-acetylcholine complex permitted a detailed structural comparison with the carbamylcholine-binding site of the acetylcholine-binding protein from the mollusc Lymnaea stagnalis. In addition to the two liganded structures of ChoX, we were also able to solve the crystal structure of ChoX in a closed, substrate-free conformation that revealed an architecture of the ligand-binding site that is superimposable to the closed, ligand-bound form of ChoX. This structure is only the second of its kind and raises the important question of how ATP-binding cassette transporters are capable of distinguishing liganded and unliganded-closed states of the binding protein