Genetisches Reassortment zwischen verschiedenen Dobrava-Virus Linien und die Zuweisung der jeweiligen Genomsegmente zur Modulation des angeborenen Immunsystems

Hantaviruses possess a tri-segmented negative-stranded RNA genome with the potency of genetic reassortment. Reassortment processes between genome segments might cause dramatic changes in the virulence of viruses as has been shown for influenza viruses. The European Dobrava-Belgrade virus species (DOBV) forms distinct lineages associated with different Apodemus mice species and can cause hemorrhagic fever with renal syndrome of different clinical severities. In this study, virological and molecular tools to monitor RNA reassortment in cell culture between two genetic lineages of DOBV were established. Representatives of the DOBV-Af (associated with A. flavicollis) and DOBV-Aa (associated with A. agrarius) lineages were used for dual infection of Vero E6 cells. Two hundred and seven individual virus clones were isolated and screened for reassortment by a newly established strain- and segment-specific multiplex PCR (MP PCR). After co-infection, as much as 31% of virus progeny population was represented by genetically stable reassortants. Reassortment was proven by sequence analyses of the complete S and M segments as well as L-ORF. Two stable reassortment patterns where identified. In all cases, S and L segments originated from the same parental strain and only the M segment was exchanged. Since the different virulence of DOBV-Aa vs. DOBV-Af in humans could be associated with the two viruses´ different abilities to modulate the innate immune response of the host; Three “read-out markers” (physiological role of RIG-I on virus replication, induction of the interferon stimulated response element and of the antiviral MxA protein) after virus infection were investigated. Clear differences to modulate these parameters of innate immune responses were found between DOBV-Aa on the one hand and DOBV-Af on the other. These two different phenotypes were reflected by the two types of reassortants carrying the respective S and L segments of the parental virus. The differential induction/modulation of innate immune responses might represent an important determinant of (different) virulence of hantaviruses in the human organism.Hantaviren besitzen ein in drei Segmente gegliedertes, einzelsträngiges RNA Genom in Negativstrangorientierung. Aufgrund der Segmentierung besteht die Möglichkeit des genetischen Reassortment. Genetisches Reassortment zwischen Genomsegmenten verschiedener Viren kann zu dramatischen Veränderungen der Virulenz führen, wie es für Influenzaviren beschrieben ist. Die europäische Virus Spezies Dobrava-Belgrad (DOBV) bildet, assoziiert mit verschiedenen Apodemus Spezies, verschiedene genetische Linien und verursacht hämorrhagisches Fieber mit renalem Syndrom mit verschieden schweren klinischen Verläufen. In dieser Doktorarbeit wurden virologische und molekularbiologische Methoden etabliert um genetisches Reassortment zwischen zwei genetischen DOBV- Linien in Zellkultur nachzuweisen und zu untersuchen. VeroE6 Zellen wurden mit Vertretern der genetischen Linien DOBV-Af und DOBV-Aa ko-infiziert. Insgesamt wurden 207 Virusklone isoliert und mittels einer neu etablierten stamm- und segmentspezifischen Multiplex-PCR analysiert. Es wurden 31% der isolierten Virusklone als genetisch stabile Reassortanten identifiziert. Das genetische Reassortment wurde durch Sequenzanalysen des kompletten S und M Segments und des kompletten open reading frame des L Segments bestätigt. Es wurden nur zwei stabile Reassortmentmuster gefunden; in beiden Fällen stammten das S and L Segment von dem gleichen Elternstamm, während das M Segment ausgetauscht war. Die unterschiedliche Virulenz von DOBV-Aa gegenüber DOBV-Af im Menschen könnte mit der Fähigkeit beider Viren korrelieren, das angeborene Immunsystem unterschiedlich zu modulieren. Drei „Read Out Marker“, die physiologische Rolle von RIG-I für das Wachstum von Hantaviren, sowie die Aktivierung des „interferon stimulated response Element“ und die Induktion des antiviralen MxA Proteins, wurden untersucht. Anhand dieser Parameter wurden klare Unterschiede in der Modulierung der angeborenen Immunantwort durch DOBV-Aa auf der einen Seite und durch DOBV-Af auf der anderen Seite gefunden. Diese beiden Phänotypen wurden durch die Reassortanten, die das S und L Segment des jeweiligen Elternvirus trugen, bestätigt. Die unterschiedliche Beeinflussung der angeborenen Immunantwort kann eine mögliche Determinante der Virulenz von Hantaviren im menschlichen Organismus aufzeigen

RNA helicase retinoic acid-inducible gene I as a sensor of Hantaan virus replication

Hantaan virus (HTNV) causes severe human disease. The HTNV genome consists of three ssRNA segments of negative polarity that are complexed with viral nucleocapsid (N) protein. How the human innate immune system detects HTNV is unclear. RNA helicase retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) does not sense genomic HTNV RNA. So far it has not been analysed whether pathogen-associated molecular patterns generated during the HTNV replication trigger RIG-I-mediated innate responses. Indeed, we found that knock-down of RIG-I in A549 cells, an alveolar epithelial cell line, increases HTNV replication and prevents induction of 2',5'-oligoadenylate synthetase, an interferon-stimulated gene. Moreover, overexpression of wild-type or constitutive active RIG-I in Huh7.5 cells lacking a functional RIG-I diminished HTNV virion production. Intriguingly, reporter assays revealed that in vitro-transcribed HTNV N RNA and expression of the HTNV N ORF triggers RIG-I signalling. This effect was completely blocked by the RNA-binding domain of vaccinia virus E3 protein, suggesting that dsRNA-like secondary structures of HTNV N RNA stimulate RIG-I. Finally, transfection of HTNV N RNA into A549 cells resulted in a 2 log-reduction of viral titres upon challenge with virus. Our study is the first demonstration that RIG-I mediates antiviral innate responses induced by HTNV N RNA during HTNV replication and interferes with HTNV growth