Vitrification of immature bovine oocytes loaded in suport with distinct heat conductivities

The main objective of Cryobiology is the optimization of an oocyte cryopreservation technique. It will permit to create germoplasm banks for maintenance of animal biodiversity, serving as an important instrument in transgenic, cloned or in vitro produced animals. It is consensus that the vitrification is the best method to cryopreserve oocytes and that high cooling rates improve the viability. To evaluate the use of carrier tools with different thermal conductivity in vitrification, 1.454 oocytes (Experiment 1) were 30 seconds exposed to 10% EG + 10% DMSO + 20% estrus mare serum (SEE) in TCM Hepes. Just after, groups of 5 or 6 oocytes were exposed (20 seconds) to vitrification solution (SV - 20% EG + 20% DMSO and 0.5M Sucrose). They were loaded in PM (stainless metallic straws, n=265), MV (glass micropipette, n=279), PB (straw bevel cuted, n=280), OPS (open pulled straw, n=272) or maintained without vitrification GC (control group n=358). Vitrification was obtained by plunging it in super cooled liquid nitrogen. In the experiment 2 (n=709) the aim was to evaluate bovine oocytes vitrification in reduced (25 and 50%) cryoprotectants concentration. Oocytes were 30 sec. exposed to the first cryoprotectant solution, and just after during 20 seconds to one of the allows vitrification solutions: SV100 (n=187), 20% EG + 20% DMSO + 0.5M Suc; SV75 (n=187), 15% of EG + 15% of DMSO and 0.375M of Suc; or SV50 (n=146), 10% of EG, 10% of DMSO + 0.25M Suc. A non vitrified group (n=189) was used as control. The re-warming was performed by exposure (5 minutes each) to decreasing sucrose solutions (0.30 and 0.15M), heated up to 35ºC. The oocytes were then maturated, fertilized, and the presumptive zygotes cultured in SOFaaci medium, at 39ºC, in saturated humidity. Cleavage, blastocysts and hatching rates were used as viability criteria. In the experiment 1 there was not differences in cleavage rates (p>0.05) among treatments, that were lower (P <0.05) than control group. In the vitrified groups, higher blastocyst rates were obtained with PM treatment (10.2%), that was lower (P <0.05) than the OPS (6.1%) and PB (6.1%) treatments, not differing from the MV group (8.0%), although with tendency of be higher (P <0.1). The treated groups had identical hatching rates, which were lower than the control group. In the second experiment, there was not difference in the cleavage rate among SV100 and SV75 treatments, being both higher (p <0.05) than the SV50 treatment. In the blastocyst rates, there was difference among all groups (P <0.05). The higher rate was obtained in control group (38.0%), followed by the SV100 (10.1%), SV75 (7.6%) and SV50 (0.5%) treatments, respectively. The hatching rates of SV100 and SV75 groups were similar, being lower (P <0.05) than control group. In the SV50 group none blastocyst hatched. We conclude that increasing cooling speed rates improves the viability of immature vitrified bovine oocytes, and that the metallic straws are more effective than recipients of lower conductivity (plastic straws), with a tendency of superiority when compared to the glass micropipette. Still, the reduction of the cryoprotectors in 25% or up does not allow an appropriate cryoprotection to vitrify bovine oocytes, in the conditions of this studyA otimização da técnica de vitrificação de oócitos é um dos principais objetivos da criobiologia, pois possibilitará a formação de bancos de germoplasma para manutenção da biodiversidade animal, além de se constituir num importante instrumento na produção de animais transgênicos, clones ou programas de produção in vitro de animais. É consenso que a vitrificação é o método mais adequado para criopreservar oócitos e que elevadas taxas de resfriamento melhoram a viabilidade da técnica. Para avaliar o uso de materiais com diferentes condutividade térmica na vitrificação (Experimento 1), 1454 oócitos foram utilizados. Inicialmente os oócitos foram expostos a 10% EG + 10% DMSO + 20% soro de égua em estro (SEE), em TCM Hepes, por 30 segundos. Após, grupos de 5 ou 6 oócitos foram submetidos à solução de vitrificação (SV) composta de 20% EG + 20% DMSO e 0,5M Sacarose, durante 20 segundos, período em foram envasados e mergulhados em nitrogênio super-resfriado. O envase foi realizado em PM (palheta metálica inoxidável, n=265), MV (micropipeta de vidro, n=279), PB (palheta cortada em bisel, n=280), OPS (open pulled straw, n=272). Simultaneamente, um grupo não vitrificado serviu como controle, (GC n=358). No Experimento 2, 709 oócitos foram vitrificados com concentrações reduzidas (25 e 50%) de crioprotetores. Inicialmente os oócitos foram expostos, por 30 segundos, a uma solução de 10% EG + 10% DMSO + 20% SEE, em TCM Hepes. Logo após, foram expostos, por 20 segundos, a uma das soluções de vitrificação: SV100 (n=187), 20% EG + 20% DMSO + 0,5M Sacarose; SV75 (n=187), 15% de EG + 15% de DMSO e 0,375M de sacarose; ou SV50 (n=146), 10% de EG, 10% de DMSO + 0,25M de sacarose, além de um grupo controle não vitrificado (n=189). O reaquecimento foi realizado pela exposição (5 minutos cada) às soluções decrescentes de sacarose (0,30 e 0,15M), aquecidas a 35ºC. Os oócitos foram então maturados e fecundados, e os prováveis zigotos cultivados em meio SOFaaci, à 39ºC. As taxas de clivagem, de blastocistos e eclosão foram utilizadas com critérios de viabilidade. No experimento 1 não foram verificadas diferenças (P>0,05) nas taxas de clivagem dos tratamentos, que foram inferiores (P<0,05) ao grupo controle. A maior taxa de blastocistos nos grupos vitrificados foi obtida com o tratamento PM (10,2%), que foi superior (p<0,05) aos tratamentos OPS (6,1%) e PB (6,1%), não diferindo do grupo MV (8,0%), embora com tendência de ser superior (p<0,1). Também as taxas de eclosão nos grupos tratados foram semelhantes, sendo inferiores as do grupo controle. No experimento 2, não houve diferença na clivagem entre os tratamentos SV100 e SV75, sendo ambos superiores (P<0,05) ao tratamento SV50. Na taxa de blastocistos, houve diferença entre todos os tratamentos (p<0,05). A maior taxa foi obtida com o grupo controle (38,0%), seguido do tratamento SV100 (10,1%), SV75 (7,6%) e SV50 (0,5%), respectivamente. As taxas de eclosão dos grupos SV100 e SV75 foram semelhantes, sendo inferiores (p<0,05) ao controle. No grupo SV50 não houve eclosão. Conclui-se que o aumento da velocidade de resfriamento melhora a viabilidade pós vitrificação de oócitos bovinos imaturos, sendo que as palhetas metálicas são mais efetivas que os recipientes de menor condutividade (palhetas plásticas), com uma tendência de superioridade quando comparada à micropipeta de vidro. Ainda, a redução dos crioprotetores em percentual igual ou superior a 25% não permite uma adequada crioproteção na vitrificação de oócitos bovinos, com a metodologia proposta neste estud

Superovolutory protocol with equine pituitary extract (EPE) in mares Crioula and the Quarter Horse

Este trabalho compara a resposta superovulatória de éguas doadoras de embriões das raças Quarto de Milha (QM) e Crioula, utilizando um protocolo com baixa dose de extrato de pituitária equina (EPE). Oito éguas QM e seis éguas Crioulas foram acompanhadas durante 3 ciclos estrais consecutivos, sendo que cada ciclo corresponde a um grupo. Grupo Controle – monitoramento do crescimento folicular até a ovulação; Grupo EPE – monitoramento ultrassonográfico até que os folículos atingissem cerca de 20 mm de diâmetro e, posteriormente, administração de 7 mg de EPE, duas vezes ao dia, até a indução da ovulação com 2500UI de hCG; Grupo Pós-EPE – idem ao grupo controle. Os dados foram submetidos à análise de variância, utilizando o procedimento GLM do pacote estatístico SAS, sendo previamente testadas para normalidade dos resíduos, e as médias comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5%. Nas éguas Crioulas tratadas com EPE houve um aumento no número de ovulações (p=0,0534), com média de 3,33±2,06 quando comparadas aos grupos controle e pós-EPE e às éguas da raça QM (2,00±0,53). O tratamento com EPE na dose preconizada permitiu uma melhor resposta superovulatória e produção embrionária nas éguas Crioulas, quando comparadas com as éguas Quarto de Milha.This study compared the superovulatory response of embryos donor mares of Quarter Horse (QH) and Crioula using a protocol with low dose of equine pituitary extract (EPE). Eight QH mares and six Crioula mares were monitored during 3 consecutive estrous cycles, with each cycle corresponds to a group. Control Group - monitoring of follicle growth up to the ovulation; EPE group - when the follicles reached 20 mm in diameter were administered 7 mg EPE twice daily. When the follicles achieved a diameter 35 mm, the ovulation was induced with 2500UI hCG; Post-EPE Group - idem to the control group. Data were analyzed using GLM procedure of the SAS statistical package. The variables were submitted to the Tukey’s test and least square means adjusted for multiple comparisons using the Tukey-Kramer’s test, with significance level of 5%. Values are presented as mean ± SD. In the Crioula mares treated with EPE, there was an increase in the number of ovulations (p =0.0534) with a mean of 3.33 ± 2.06 ovulations when compared to the control and post-EPE groups, and mares QM. (2.00±0.53). Treatment with EPE in the recommended dose allowed better superovulatory response and rate of embryo recovery in Crioula mares when compared to the QM mare

Neospora spp. antibodies in horses from two geographical regions of the state of Santa Catarina, Brazil

The aims of this study were to determine occurrences ofNeospora spp. IgG antibodies in horses from two geographical regions of the state of Santa Catarina, southern Brazil, and identify risk factors for infection. Analyses were performed on 615 samples using the immunofluorescent antibody test (IFAT ≥ 1:50). Out of the 615 samples, 25 (4.1%) were positive for Neospora spp. The titers for Neospora spp. were distributed as follows: 1:50 (13), 1:100 (eight), 1:200 (three) and 1:400 (one). Out of the 311 samples taken in the mountain region, eight were positive (2.6%). Among the samples from the coastal region (304), 17 had Neospora spp. antibodies, thus indicating occurrence of 5.6%. Although no statistically significant difference was observed (P = 0.06704), the prevalence among animals of the coast was 2.2 times higher than that of the mountain region. Contact with dogs and/or cattle (P = 0.007596) were identified as risk factor forNeospora spp. infection