sec遺伝子による新たなシナプス伝達制御機構の解明

金沢大学医薬保健研究域医学系新たなシナプス伝達機構の探索を目的として、小胞の形質膜結合に関与すると推定されるSec関連遺伝子の線虫ホモログ、Sec10, 15, 5及びExo70遺伝子をクローン化した。RT-PCR及びC. eleg ans cDNAライブラリーからSec10 cDNAは1,980bp、Sec5 cDNAは2,660bp、Exo70 cDNAは1,900bpのほぼ全長のcDNAクローンを得た。Sec15 mRNAはノーザンブロット解析から5.3, 3.8, 2.9, 1.7と1.1kbの少なくとも5つが確認されたが、スクリーニングの結果3\u27領域の異なるクローンがこれまでに11種存在することを突き止めた。これらはAからGのグループに分類された。しかしながら、5.3kbに相当するcDNAクローンは得られていないため、5\u27及び3\u27RACE法によるクローニングを試みている。Sec関連遺伝子の発現を調べるため、プロモーター領域を含むそれぞれのゲノムDNA断片をGFPをレポーター遺伝子として持つ発現ベクターに組み込み、マイクロインジェクションにより導入し、トランスジェニック線虫で遺伝子局在を調べた。いずれのSec関連遺伝子共に神経系と腸に局在が見られた。特に、神経系ではmotor neuronと一部の頭部神経細胞で発現が見られ、これら遺伝子は神経特異的なunc-18, unc-64遺伝子の局在と極めて類似していた。このことからSec関連遺伝子はシナプス前終末で機能していると推定され、シナプス小胞の分泌に深く関わっていると示唆された。さらに、これら遺伝子の機能を調べるため無細胞系タンパク質発現系によりSEC10とUNC-18タンパク質を発現させ、結合能を調べた。弱いながらも両者は結合したことから、SEC10はシナプス前終末で機能し、UNC-18を介したシナプス伝達機構に関連すると考えられた。研究課題/領域番号:12780581, 研究期間(年度):2000-2001出典：「sec遺伝子による新たなシナプス伝達制御機構の解明」研究成果報告書　課題番号 12780581（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-12780581/)を加工して作

Exocyst複合体を介した新たなシナプス伝達制御機構の解明

金沢大学医薬保健研究域医学系新たなシナプス伝達機構の解明を目的として、小胞の形質膜結合に関与すると推定されるExocyst複合体に注目し関連遺伝子の線虫ホモログ、Sec5,10,15及びExo70遺伝子のクローン化を行った。その結果を基に、発生段階におけるそれぞれの遺伝子転写産物の定量的PCRによる遺伝子発現レベルの検討を行った。Sec5,10及びExo70遺伝子の発現はEmbryo期で最も高く、ステージ移行とともに減少していた。このことは神経系の発生にもこれら遺伝子が関与すると推測される。Sec15遺伝子は、今回、新たに1種の転写産物の存在が明らかになり、これまでに6種が判明している。基本となるcDNAは24個のエキソンからなるが、その他の転写産物はオルターネイティブスプライシングよりなっていた。いずれの転写産物もエキソンが短いことからPCRの性質上定量的解析にはいたっていない。しかし、この遺伝子は神経系と腸に発現することから分泌系に機能していることは確実である。クローン化したSec3,Sec5,Sec10,Sec15,Exo70,Exo84遺伝子cDNAをHis-tag又はGST-tagを有するタンパク発現ベクターに組込み、大腸菌内で大量発現させた。発現させたタンパク質をGlutathion Sepharoseカラム或いはNi^カラムを用いて精製を試みたが、ほとんどのタンパク質は不溶性であったことから、さらに可溶性のタグを持つベクターにサブクローニングし、発現、精製を行った。精製を行ったSEC10とUNC-18との結合実験からSEC10はUNC-18と相互作用することが判明した。これによりSEC10は神経伝達物質の放出に関与すると考えられた。研究課題/領域番号:14780579, 研究期間(年度):2002-2003出典：「Exocyst複合体を介した新たなシナプス伝達制御機構の解明」研究成果報告書　課題番号14780579（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-14780579/)を加工して作

神経系における低周波交流磁界刺激感受メカニズムの解明

低周波交流磁界が生体、特に神経系にどのような影響を及ぼすかを調べるためモデル動物である線虫C.elegansを用いて磁界曝露による遺伝子発現レベルの変化と行動解析を行った。C.elegansに対して0.5Tの磁界を2時間暴露後、RNAを抽出し、前年度行ったマイクロアレイによる包括的なスクリーニングから発現に差があると見られる神経系遺伝子を抽出し、再現性の高いRT-PCRによる磁界曝露、非磁界曝露でのRNA発現量を比較した。マイクロアレイの結果、神経系関連遺伝子の多くはCa^に関連しており中でもカルモジュリンキナーゼIIをコードするunc-43遺伝子は磁界曝露により2.7倍の発現減少が認められ、RT-PCRの結果では2.35倍の減少を認めた。このことからCa^濃度を制御するカルモジュリン経路関連遺伝子(ckk-1(CaMKK), crh-1(CREB), cmk-1(CaMKIV), tax-6,cnb-1(Calcineurin)及びitr-1(IP3R))についてRT-PCRにより磁界曝露による遺伝子発現を検討した結果、unc-43,itr-1,cnb-1及びtax-6遺伝子は優位にRNAの発現が減少(P濃度の変化を惹起させ遺伝子発現レベルを変化させることで行動に異常をもたらした可能性が示唆された。The biological effect of extremely low frequency magnetic fields (ELFMFS) remains controversial. Some epidemiological studies have indicated positive correlations between magnetic fields and various types of cancer or other disease, including neurological disorders. To clarify the biological effects of ELFMFs, we performed the screening of ELFMFS-responding genes by using microarray technique in nematode C. elegans, as a model organism, and carried out the RT-PCR analysis not only the genes with significant difference identified by microarray, but also the associative and relative genes with possibility of ELFMFs-responding genes. Moreover, we investigated chemotactic response to either diacetyl or CuSO_4 after ELFMFs exposing.unc-43, one of the identified genes, is known to function as calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), that mediates Ca^ signal transmission in the nervous system of C. elegans. We found that unc-43 mRNA was down-regulated (2.4-fold) under ELFMFs exposure by RT-PCR. Another related genes, tax-6 (Calcineurin), itr-1 (IP3R) and cnb-1 (Calcineurin) in Ca^-Calmodulin (CaM) pathway were significantly down-regulated, respectively. ckk-1 (CaMKK), crh-1 (CREB) and cmk-1 (CaMKIV) showed no significant decrease (P<0.1), though these genes were reported to be functioning in the CaM pathway,.In behavioral analysis, chemotaxis index to diacetyl decreased, also chemotaxis index to CuSO_4 was shown weakly defective in avoidance when exposed with ELFMFs.These results suggest that the ELFMFs exposure caused the expression changes of neuronal specific genes which are associated with a part of calcium signal cascades, and has affected spontaneous locomotoion in C. elegans.研究課題/領域番号:13555218, 研究期間(年度):2005-200

シナプス終末で働く遺伝子群の共役的発言制御機構の解明

金沢大学医薬保健研究域医学系記憶等神経高次機能を制御する神経細胞間情報伝達はシナプスによって担われている。原田はこれまでに、神経伝達物質がシナプス前終末に異常蓄積する変異体の解析から正常なシナプス伝達にはこれらの遺伝子群が神経細胞で共役的に発現することが必須であることを明らかにした。この共役的遺伝子発現の調節機構の解明がシナプス伝達を知る鍵となると考えられる。そこで、(1)シナプス伝達関連遺伝子群の共役的発現制御領域をを明らかにし、(2)神経前終末遺伝子発現の共通性・互換性からシナプス伝達に寄与する因子の遺伝子発現制御ネットワークの構築が本研究の目的である。1.神経特異的な発現制御領域の同定のため線虫C.elegans unc-18およびunc-64ゲノムDNAをクローニングした。PCRで増幅した当該遺伝子上流域DNA断片をGreen Fluorescent Protein(GFP)をレポータ-遺伝子とする発現ベクターに組み込み、トランスジェニック線虫のGFPの発現パターンを観察した。その結果、unc-18遺伝子では上流域-366から-53bpのDNA断片で、またunc-64では上流域-800bpのDNA断片で両者共に神経特異的な発現を示した。2.C.elegansの近種であるC.briggsaeのunc-18上流域をC.elegans unc-18とDNA配列を比較したところC.elegans unc-18上流域-359から-34lbpの19bp範囲で非常に高い相同性を示せす領域を見つけた。しかし、この配列はunc-64中では高い相同性を示す領域は認められなかった。unc-18上流域内の19bpについてsite-directed mutagenesis法により2文字毎に塩基置換を行った発現ベクターを構築し、レポーター活性の局在を指標に神経特異的発現に必須なヌクレオチドを決定した。この結果から19bp内の5\u27ACX_4SSX_4TTG3\u27配列がunc-18遺伝子発現に不可欠であることを明らかにした。以上の結果からC.elegans unc-18の神経特異的な遺伝子発現は上記配列に特異的に接合する因子において制御されていることが示唆されたが、unc-64上流域との比較からは共役的発現制御にはさらに別の領域が関与することが推定される。研究課題/領域番号:10780364, 研究期間(年度):1998 – 1999出典：「シナプス終末で働く遺伝子群の共役的発言制御機構の解明」研究成果報告書　課題番号10780364（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-10780364/)を加工して作

IRE1-XBP1 Pathway of the Unfolded Protein Response Is Required during Early Differentiation of C2C12 Myoblasts

ArticleInternational Journal of Molecular Sciences. 21(1): 182. (2019)journal articl

Effects of valproic acid on the cell cycle and apoptosis through acetylation of histone and tubulin in a scirrhous gastric cancer cell line

Background. Management of peritoneal dissemination is the most critical problem in gastric cancer. This study was performed to investigate the inhibitory effects of valproic acid (VPA) on a highly peritoneal-seeding cell line of human scirrhous gastric cancer, OCUM-2MD3, and to explore the mechanism and the potential of VPA. Methods. The effects of VPA on the growth of OCUM-2MD3 cells were assessed by MTT assay. In addition, paclitaxel (PTX) was combined with VPA to evaluate their synergistic effects. HDAC1 and HDAC2 expression were evaluated by western blotting in OCUM-2MD3 cells and other gastric cancer cell lines (TMK-1, MKN-28). The acetylation status of histone H3 and α-tubulin after exposure to VPA were analyzed by western blotting. The activities of cell cycle regulatory proteins and apoptosis-modulating proteins were also examined by western blotting. The effects of VPA in vivo were evaluated in a xenograft model, and apoptotic activity was assessed by TUNEL assay. Results. OCUM-2MD3 cells showed high levels of HDAC1 and HDAC2 expression compared with TMK-1 and MKN-28. The concentration of VPA required for significant inhibition of cell viability (P < 0.05) was 5 mM at 24 h and 0.5 mM at 48 h and 72 h. The inhibition of VPA with PTX showed dose-dependent and combinatorial effects. VPA increased acetyl-histone H3, acetyl α-tubulin, and p21WAF1 levels accompanied by upregulation of p27, caspase 3, and caspase 9, and downregulation of bcl-2, cyclin D1, and survivin. In the xenograft model experiment, the mean tumor volume of the VPA-treated group was significantly reduced by 36.4%, compared with that of the control group at 4 weeks after treatment (P < 0.01). The apoptotic index was significantly higher in the VPA-treated group (42.3% ± 3.5%) than in the control group (7.7% ± 2.5%) (P < 0.001). Conclusions. VPA induced dynamic modulation of histone H3 and α-tubulin acetylation in relation with the anticancer effect and the enhancement of PTX in the OCUM-2MD3 cell line. Therefore, VPA in combination with PTX is expected to be a promising therapy for peritoneal dissemination of scirrhous gastric cancer. © 2010 Yagi et al; licensee BioMed Central Ltd

Regulation of alternative splicing of the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) through G-rich cis-elements and heterogenous nuclear ribonucleoprotein H

金沢大学医薬保健研究域医学系Receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is a cell-surface receptor. The binding of ligands to membrane-bound RAGE (mRAGE) evokes cellular responses involved in various pathological processes. Previously, we identified a novel soluble form, endogenous secretory RAGE (esRAGE) generated by alternative 5′ splice site selection in intron 9 that leads to extension of exon 9 (exon 9B). Because esRAGE works as an antagonistic decoy receptor, the elucidation of regulatory mechanism of the alternative splicing is important to understand RAGE-related pathological processes. Here, we identified G-rich cis-elements within exon 9B for regulation of the alternative splicing using a RAGE minigene. Mutagenesis of the G-rich cis-elements caused a drastic increase in the esRAGE/mRAGE ratio in the minigene-transfected cells and in loss of binding of the RNA motif to heterogenous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) H. On the other hand, the artificial introduction of a G-stretch in exon 9B caused a drastic decrease in the esRAGE/mRAGE ratio accompanied by the binding of hnRNP H to the RNA motif. Thus, the G-stretches within exon 9B regulate RAGE alternative splicing via interaction with hnRNP H. The findings should provide a molecular basis for the development of medicines for RAGE-related disorders that could modulate esRAGE/mRAGE ratio. © The Authors 2009. Published by Oxford University Press on behalf of the Japanese Biochemical Society. All rights reserved