Изменение морфологии эритроцитов после действия моноксида углерода на кровь in vitro

Background: One of the pathological effects of carbon monoxide (CO) on blood is the formation of carboxyhemoglobin. Carboxyhemoglobin completely blocks oxygen transfer; therefore, there is a net decrease in oxygen transport by red blood cells potentially resulting in tissue hypoxia. The effects of CO on blood can also damage cell membranes. Atomic force microscopy (AFM) has been recognized as effective for investigation into the mechanisms of structural damage in erythrocyte membranes. Aim: By means of AFM, to identify characteristics of changes in morphology and aggregation of erythrocytes exposed to CO in vitro.Materials and methods: All experiments were performed in vitro. We studied the morphology of erythrocytes and their aggregates with AFM. Blood sampling (150 μl) in microvettes with EDTA (Sarstedt AG Co., Germany) was carried out during a prophylactic work-up of 5 volunteers. To obtain CO in a test tube, formic acid was mixed with sulfuric acid 1:1. Blood levels of carboxyhemoglobin were measured by spectrophotometry. A nonlinear fitting method of the experimental spectra was used to calculate the concentrations of hemoglobin derivatives in blood. Statistical analysis was done with the Origin software (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).Results: After CO exposure, a shift in peaks was observed. At exposure time t₂=320 s, the percentage of carboxyhemoglobin (CHbCO) was 88±2%. As a result of blood exposure to CO, at t₁=160 s 10% of the cells differed in their shape from discocytes, whereas at t₂=320 s their proportion was 38%. With increasing duration of exposure to CO, erythrocyte aggregation occurred with formation of their large conglomerates up to 30 μm in size. In the control smear, the proportion of discocytes was 96±2%, and the remaining 4±1% of the cells had the form of echinocytes. The cell diameter (Dcont) was in the range 7.5±0.8 μm. After blood exposure to CO at t₁=160 s in the monolayer, 28±5% of cells had a diameter less than5.7 μm. After CO exposure at t₂=320 s, the proportion of cells with a diameter of less than5.7 μm increased to 72±11%.Conclusion: The experiments have shown that blood exposure to CO changed the morphology of erythrocytes. The formation of interconnected structures made of red blood cells was observed. With increased time of exposure, erythrocytes demonstrated aggregation with conglomerate formation.Актуальность. Одно из патологических действий моноксида углерода (СО) на кровь – образование карбоксигемоглобина. Поскольку карбоксигемоглобин полностью блокирует перенос кислорода, происходит суммарное снижение транспорта кислорода эритроцитами. В результате может возникнуть гипоксия в тканях. Воздействие СО на кровь может также вызвать повреждение клеточной мембраны. Метод атомной силовой микроскопии (АСМ) признан результативным для изучения механизмов структурных повреждений в мембранах эритроцитов.Цель – с помощью АСМ выявить особенности изменения морфологии и агрегации эритроцитов в результате действия СО in vitro.Материал и методы. Все эксперименты были проведены in vitro. Исследовали морфологию эритроцитов, их агрегаты с помощью АСМ. Забор крови (150 мкл) проводился в микроветы с ЭДТА (Sarstedt AG Co., Германия) во время профилактического обследования 5 добровольцев. Для получения CO в пробирке смешивали в пропорции 1:1 муравьиную и серную кислоты. Для измерения концентрации карбоксигемоглобина в крови использовали спектрофотометрический метод, для вычисления концентраций производных гемоглобина в крови – метод “nonlinear fitting” экспериментальных спектров. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Origin (OriginLab Corporation, США).Результаты. После воздействия СО происходило смещение пиков. При времени воздействия t₂=320 c процентное содержание карбоксигемоглобина составило CHbCO =88±2%. При t₁=160 c 10% клеток имели форму, отличную от дискоцитов, при t₂=320 c – 38% клеток. При увеличении времени воздействия СО происходила агрегация эритроцитов и образование их больших конгломератов размером до 30 мкм. В контрольном мазке доля дискоцитов составляла 96±2%, а остальные 4±1% имели форму эхиноцитов. Диаметр клеток был в диапазоне Dконтр=7,5±0,8 мкм. После воздействия СО t₁=160 c на кровь в монослое наблюдалось 28±5% клеток с диаметром (D)5,7 мкм. После воздействия СО t₂=320 c процент клеток с размером D5,7 мкм увеличился до 72±11%.Заключение. Экспериментально показано, что воздействие СО на кровь вызывало изменение морфологии эритроцитов. Наблюдалось формирование связанных между собой эритроцитарных структур. При увеличении времени воздействия возникала агрегация эритроцитов и образование конгломератов

Атомно-силовая микроскопия в оценке механических свойств мембран эритроцитов при воздействии различных физико-химических агентов

Background: Mechanical properties of cell membranes and their structural organization are considered among the most important biological parameters affecting the functional state of the cell. Under the influence of various pathogenic factors, erythrocyte membranes lose their elasticity. The resulting changes in their biomechanical characteristics is an important, but poorly studied topic. It is of interest to study the deformation of native erythrocytes to a depth compatible with their deformation in the bloodstream.Aim: To investigate the patterns of deep deformation and the particulars of structural organization of native erythrocyte membranes before and after their exposure to physicochemical agents in vitro.Materials and methods: Cell morphology, nanostructure characteristics, and membrane deformation of native erythrocytes in a  solution of hemoconservative CPD/SAGM were studied with atomic force microscope NTEGRA Prima. Hemin, zinc ions (Zn2+), and ultraviolet (UV) radiation were used as modifiers. To characterize the membrane stiffness, we measured the force curves F(h), hHz (the depth to which the probe immersion is described by interaction with a homogeneous medium), and the Young's modulus values of the erythrocyte membrane.Results: Exposure to hemin, Zn2+ and UV radiation led to transformation of the cell shape, appearance of topological defects and changes in mechanical characteristics of erythrocyte membranes. Under exposure to hemin, Young's modulus increased from 10±4  kPa to 27.2±8.6  kPa (p0.001), exposure to Zn2+, to 21.4±8.7  kPa (p=0.002), and UV, to 18.8±5.6  kPa (p=0.001). The hHz value was 815±210  nm for the control image and decreased under exposure to hemin to 420±80 nm (p0.001), Zn2+, to 370±90 nm (p0.001), and UV, to 614±120 nm (p=0.001).Conclusion: The results obtained contribute to a  deeper understanding of interaction between membrane surfaces of native erythrocytes and small vessel walls. They can be useful in clinical medicine as additional characteristics for assessment of the quality of packed red blood cells, as well as serve as a basis for biophysical studies into the mechanisms of action of oxidative processes of various origins.Обоснование. Механические свойства мембран клеток и  их структурная организация считаются одними из наиболее важных биологических параметров, влияющих на функциональное состояние клетки. При воздействии патогенных факторов различной природы мембраны эритроцитов теряют эластичность. Как при этом изменяются их биомеханические характеристики – вопрос важный, но малоизученный. Представляется интересным изучить деформацию нативных эритроцитов на глубину, соизмеримую с их деформацией в кровотоке.Цель  – исследовать закономерности глубокой деформации и  особенности структурной организации мембран нативных эритроцитов до и  после воздействия физико-химических агентов in vitro.Материал и  методы. Морфологию клеток, особенности наноструктуры и  деформации мембран нативных эритроцитов в  растворе гемоконсерванта CPD/SAGM исследовали с  использованием атомно-силового микроскопа NTEGRA Prima. В качестве модификаторов применяли гемин, ионы цинка (Zn2+) и  ультрафиолетовое излучение (УФ). Для характеристики жесткости мембраны измеряли силовые кривые F(h), hHz – глубину, до которой процесс погружения зонда описывается взаимодействием с однородной средой, а также оценивали величину модуля Юнга мембраны эритроцитов.Результаты. Установлено, что воздействие гемина, Zn2+ и УФ приводило к трансформации формы клеток, возникновению топологических дефектов и  изменению механических характеристик мембран эритроцитов. При воздействии гемина модуль Юнга увеличился с  10±4 до 27,2±8,6 кПа (p0,001), под влиянием Zn2+ – до 21,4±8,7  кПа (p=0,002), УФ  – до 18,8±5,6  кПа (p=0,001). Величина hHz составила 815±210  нм для контрольного образца и  уменьшалась после действия гемина до 420±80  нм (p0,001), Zn2+ – до 370±90 нм (p0,001), УФ – 614±120 нм (p=0,001).Заключение. Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию процессов взаимодействия поверхностей мембран нативных эритроцитов со стенками мелких сосудов и могут быть полезны в клинической медицине как дополнительные характеристики при оценке качества эритроцитов, а  также послужить основой для биофизических исследований механизма действия окислительных процессов различного происхождения.