VARIAZIONE DI MARKERS MOLECOLARI IN PAZIENTI CON ANEURISMA CEREBRALE

Titolo della tesi: Variazione di marker molecolari in pazienti con aneurisma cerebrale Introduzione. INTRODUZIONE L¡¯aneurisma ¨¨ una patologia dell¡¯apparato vascolare che si manifesta come una dilatazione abnorme di un vaso che pu¨° colpire qualsiasi vena o arteria del corpo. In particolare un aneurisma cerebrale ¨¨ localizzato nel punto di biforcazione delle arterie cerebrali che costituiscono il poligono di Willis; la sua insorgenza pu¨° dipendere da fattori congeniti o acquisiti. La prima manifestazione clinica, nella maggior parte dei casi ¨¨ rappresentata da un¡¯emorragia, dovuta alla rottura della parete dei vasi, a livello dello spazio subaracnoideo. Studi condotti su pazienti affetti da tale patologia hanno evidenziato la presenza di fenomeni infiammatori associati a variazioni di marker biologici specifici sia in campioni tissutali che plasmatici. La componente infiammatoria ¨¨ associata a fenomeni di rimodellamento della parete vasale, in particolare a livello della tonaca media. SCOPO DEL LAVORO Lo studio, effettuato in collaborazione con la clinica di Neurochirurgia dell¡¯Ospedale ¡°Santa Chiara¡± di Pisa, prevede la valutazione del coinvolgimento di alcuni markers biologici nello sviluppo dell¡¯aneurisma cerebrale e le possibili interazioni tra i markers coinvolti. MATERIALI E METODI I volontari appartengono ai seguenti gruppi sperimentali: Controllo (n=10), Aneurisma non sanguinante (n=10) e Aneurisma sanguinante (n=16). I campioni di plasma prelevati sono stati utilizzati per la valutazione della concentrazione dei markers biologici (MMP-9, TIMP-1, IL-1¦Â, IL-18 e VEGF) attraverso l¡¯utilizzo di saggi immunoenzimatici (ELISA-sandwich). RISULTATI I livelli di MMP-9 aumentano significativamente sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (223.38 ¡À 31.6 vs 92.8 ¡À 21.7 ng/ml con p < 0.01) rispetto al controllo sia nel gruppo con aneurisma sanguinante (304.16 ¡À 48.6 vs 92.8 ¡À 21.7 ng/ml con p < 0.05). Non si ¨¨ invece osservata una significativa differenza tra i gruppi con aneurisma sanguinante e non sanguinante. I livelli plasmatici del TIMP-1 rimangono pressoch¨¦ invariati nei tre gruppi presi in esame: nel gruppo controllo si ha una media di 120.17 ng/ml (SD = 15.21), nel gruppo con aneurisma non sanguinante la media ¨¨ di 135.73 ng/ml (SD = 21.91) mentre nel gruppo con aneurisma sanguinante ¨¨ di 128.69 ng/ml (SD = 13.37). Nel rapporto MMP-9/TIMP-1 si ha un aumento significativo rispetto al gruppo controllo, sia nel gruppo dell¡¯aneurisma non sanguinante (3.27 ¡À 0.76 vs 0.96 ¡À 0.33 ng/ml con p < 0.01) che nel gruppo dell¡¯aneurisma sanguinante (3.38 ¡À 0.63 vs 0.96 ¡À 0.33 ng/ml con p < 0.05). Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante. I livelli di IL-1¦Â mostrano un aumento significativo di tale parametro rispetto al controllo sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (74.5 ¡À 21.27 vs 19.67 ¡À 3.78 pg/ml con p < 0.05) che nel gruppo con aneurisma sanguinante (58.06 ¡À 16.5 vs 19.67 ¡À 3.78 pg/ml con p < 0.05). Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante (p = 0.053). I livelli di IL-18 non evidenziano un aumento significativo rispetto al gruppo controllo, sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (215.6 ¡À 55.96 vs 104.8 ¡À 21.80 pg/ml con p = 0.065) che nel gruppo con aneurisma sanguinante (305.4 ¡À 95.48 vs 104.8 ¡À 21.80 pg/ml con p = 0.075). Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante. Infine i livelli di VEGF hanno mostrato un aumento significativo di tale parametro sia nel gruppo con aneurisma non sanguinante (45.60 ¡À 6.03 vs 26.08 ¡À 4.86 pg/ml con p < 0.01) che nel gruppo con aneurisma sanguinante (94.71 ¡À 36.18 vs 26.08 ¡À 4.86 pg/ml con p < 0.05) rispetto al controllo. Non vi ¨¨ invece differenza significativa tra il gruppo con aneurisma non sanguinante e quello con aneurisma sanguinante. Sono state inoltre osservate delle correlazioni tra i markers indagati: L¡¯IL-1¦Â ha evidenziato una correlazione positiva significativa con l¡¯MMP-9 (p = 0.00215) e non significativa con il VEGF (p = 0.28). L¡¯IL-18 ha una correlazione positiva significativa con l¡¯MMP-9 (p = 0.0024) e con l¡¯IL-1¦Â (p = 0.0017) e non significativa con VEGF (p = 0.62). Infine il VEGF presenta una correlazione positiva significativa solo con l¡¯MMP-9 (p = 0.011). CONCLUSIONI Sulla base dei dati emersi da questo studio ¨¨ possibile affermare che tra i meccanismi maggiormente coinvolti nello sviluppo di un aneurisma vi ¨¨ l¡¯aumento di citochine proinfiammatorie e l¡¯upregulation del sistema dell¡¯MMP, si pu¨° inoltre ipotizzare l¡¯esistenza di segnali precoci la cui espressione viene downregolata con il procedere della patologia. Infine, possibili fattori coinvolti nello sviluppo dell¡¯aneurisma sono molecole ad attivit¨¤ modulatoria e proinfiammatoria indiretta come IL-18

L’importanza di PTEN-induced kinase I (PINK-1) nella modulazione dell’autofagia in cellule dopaminergiche

La macroautofagia è un processo dinamico usato per sequestrare e degradare interi organelli o proteine mal ripiegate tramite una struttura vescicolare a doppio strato di membrana, conosciuta con il nome di autofagosoma, che, unendosi con il lisosoma favorisce la degradazione del substrato. Negli ultimi anni, è emerso per l’autofagia un ruolo sempre più importante nella neuroprotezione. Infatti, la soppressione dell’autofagia conduce a morte cellulare sia in vivo che in vitro, mentre induttori dell’autofagia rimuovono gli aggregati proteici e riducono la morte cellulare apoptotica. Recentemente è stato appurato come la PTEN-induced kinase I (PINK1) risulta essere mutata in forme genetiche di malattia di Parkinson. Comunque i meccanismi che collegano PINK1 alla morte di cellule dopaminergiche (DA) rimangono sconosciuti. Isoforme distinte di PINK1 hanno evidenziato essere attive sia all’esterno che all’interno dei mitocondri. PINK1 interagisce con la proteina pro-autofagica Beclin1 e con la proteina parkina. Lo scopo del presente studio è stato di analizzare in un sistema in vitro la modulazione genetica di PINK1 in condizioni basali e dopo trattamento con metanfetamina (MA) per valutare: 1. come la modulazione genetica di PINK1 influenzi i mitocondri 2. il coinvolgimento di PINK1 nella modulazione dell’autofagia, ed in particolar modo della “clearence” mitocondriale (mitofagia); 3. la presenza nella modulazione del processo autofagico/mitofagico, di un reclutamento da parte di PINK1 del marker generale autofagico LC3, della proteina pro-autofagica Beclin1, della proteina parkina e dell’ubiquitina; 4. la variazione nella sopravvivenza cellulare a seguito degli effetti correlati a PINK1. A tal proposito abbiamo usato 5 gruppi sperimentali di colture cellulari dopaminergiche PC12: pcDNA (vettore vuoto, controllo per PINK1wt e PINK1W437X), shSCR (vettore vuoto, controllo per shPINK1), PINK1wt, la forma mutata PINK1W437X e shPINK1 (silenziato). Queste cellule sono state studiate sia in condizioni basali sia a seguito di esposizione con MA, una neurotossina dopaminergica che induce una potente risposta autofagica compensatoria. In condizioni basali il gruppo PINK1wt evidenzia un aumento del numero di mitocondri totali per cellula, mentre mantiene una percentuale di mitocondri alterati uguale al gruppo pcDNA; i gruppi PINK1W437X e shPINK1 evidenziano al contrario un aumento della percentuale di mitocondri alterati. A seguito della somministrazione di MA il gruppo PINK1wt mantiene un aumentato numero di mitocondri totali mentre diminuisce rispetto al gruppo pcDNA la percentuale dei mitocondri alterati; l’aumentata percentuale di mitocondri alterati viene mantenuta nel gruppo PINK1W437X, ed implementata nel gruppo shPINK1. In condizioni basali si assiste nel gruppo PINK1wt all’aumento sia della percentuale di mitocondri positivi alla proteina pro-autofagica Beclin1 che del numero di particelle anti-Beclin1 presenti a livello mitocondriale, al contrario di quanto accade per PINK1W437X e shPINK1 che evidenziano una riduzione. A seguito della somministrazione di MA viene mantenuto l’andamento riscontrato nelle condizioni basali. L’analisi della percentuale di mitocondri positivi alla parkina e alla co-localizzazione Beclin1-parkina evidenzia nei gruppi PINK1W437X e shPINK1 una diminuzione, sia in condizioni basali che a seguito di somministrazione della MA, mentre nel gruppo PINK1wt si assiste ad un aumento nella percentuale di mitocondri positivi alla co-localizzazione Beclin1/parkina a seguito di somministrazione di MA. Il gruppo PINK1wt mostra un aumento del numero di cluster dell’ubiquitina a livello mitocondriale sia in condizioni basali che a seguito della somministrazione della MA; il gruppo PINK1W437X evidenzia un aumento dei cluster dell’ubiquitina in condizioni basali cui si contrappone una diminuzione a seguito della somministrazione della MA; nel gruppo shPINK1 si riscontra invece una diminuzione in condizioni basali che viene implementata a seguito della somministrazione di MA. In condizioni basali non sono riscontrati cambiamenti tra i vari gruppi di trattamento, sia nel numero di vacuoli di tipo autofagico presenti a livello cellulare, sia nel numero di molecole del marker autofagico LC3 presenti a livello di strutture endomembranose e dei vacuoli di tipo autofagico, diversamente da quanto accade a seguito della somministrazione di MA in cui nei gruppi PINK1W437X e shPINK1 si assiste ad una diminuzione rispetto ai gruppi di controllo. Infine mentre in condizioni basali la percentuale di cellule apoptotiche rimane pressoché inalterata tra i vari gruppi di trattamento, a seguito della somministrazione di MA tale percentuale risulta diminuita per il gruppo PINK1wt ed aumentata sia nel gruppo PINK1W437X che, in modo più eclatante, nel gruppo shPINK1

Morphological analysis of genetic modulation of PINK1 on mitochondrial alterations, autophagy and cell death

Mutations in the PTEN-induced putative kinase1 (PINK1) represent the second most common cause of autosomal recessive Parkinson’s disease. The PINK1 protein has a mitochondrial localization and interacts with a variety of proteins, including the pro-autophagy protein beclin1 and the ubiquitin-ligase parkin. In particular, PINK1 is able to recruit parkin to the surface of dysfunctional mitochondria, to promote the ubiquitination of several mitochondrial proteins and the subsequent activation of the mitophagy cascade. Aim of this study was to use a dopaminergic cell model and transmission electron microscopy to characterize whether the modulation of PINK1 expression: (i) modifies the number and morphology of mitochondria and of autophagy organelles (autophagosomes); (ii) alters the recruitment of beclin1, parkin and ubiquitin to the mitochondria; (iii) affects cell survival. We used PC12 cells transfected either with the empty vector (pcDNA), or vectors expressing wild type PINK1 (PINK1wt), a pathogenic mutant (PINK1W437X), shRNA against rat PINK1 (shPINK1) or scramble (shSCR). Samples were analyzed both in baseline conditions and following methamphetamine (METH) treatment to provide a neurotoxic, autophagy-dependent stimulation. We showed that, especially upon METH exposure, the modulation of PINK1 levels dramatically affected the morphology and clearance of mitochondria. In fact, the number of abnormal mitochondria was reduced in PINK1wt, while it was significantly increased upon shPINK1 and also, to a lesser extent, in PINK1W437X cells. In keeping with this, mitochondrial ubiquitin clusters and mitochondrial levels of parkin and beclin1 were increased in PINK1wt cells while they were reduced both in PINK1 silenced and PINK1W437X cells. Interestingly, the number of autophagic vacuoles was unaffected by PINK1 modulation in baseline conditions, and was significantly reduced only in cells lacking functional PINK1 and upon METH exposure. All these effects were significantly associated with a modulation of apoptotic cell death. Our data provide robust sub-cellular evidence that PINK1 counteracts neurodegeneration by simultaneously recruiting beclin1, parkin and ubiquitin and thus enhancing the clearance of damaged mitochondria. In the absence of functional PINK1 and upon autophagy stress, we observed a failure of the autophagy system at large, with marked accumulation of dysfunctional mitochondria and dramatic increase in apoptotic cell death