Flavin-Dependent Monooxygenases from N-oxygenating Arctiids

Pflanzen, die Pyrrolizidinalkaloide (PAs) synthetisieren, verfügen durch die PAs über eine effektive chemische Abwehr gegen nicht angepasste Herbivoren. Aus der Familie der Arctiiden (Bärenspinner) sind eine Reihe von Arten bekannt, deren Raupen PA-haltige Pflanzen fressen können. Dabei können die angepassten Arctiiden diese Pflanzen nicht nur als Nahrungsressource nutzen sondern vielmehr die in den Pflanzen enthaltenen PAs aufnehmen, speichern und zur Verteidigung gegen eigene Fraßfeinde einsetzen. Bei Tyria jacobaeae (Arctiidae) konnte das für diese Anpassung essentielle Enzym die Senecionin N-Oxygenase (SNO) identifiziert werden. Die SNO, eine Flavin-abhängige Monooxygenase (FMO), katalysiert die N-Oxygenierung von tertiären PAs in das korrespondierende N-Oxid. Mit Hilfe von degenerierten Primern wurden aus Proben von den Arctiiden Grammia geneura, Arctia caja und Arctia villica, für die eine N-Oxygenierung nachgewiesen werden konnte, cDNA-Klone identifiziert, die aufgrund der Sequenzidentitäten den Flavin-abhängigen Monooxygenasen zugeordnet werden konnten. Dabei lassen sich die Sequenzen der identifizierten cDNA-Klone in zwei Gruppen einteilen. Die FMO-Sequenz von G. geneura, die eine hohe Übereinstimmung zur bereits gut charakterisierten SNO von T. jacobaeae aufweist, wurde heterolog in E. coli exprimiert. Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität wurde ein Meßverfahren mit radioaktiv markierten Senecionin (PA) eingesetzt. Für das heterolog exprimierte Protein konnte eine N-Oxygenierung des tertiären Senecionins nachgewiesen werden. Das heterolog exprimierte Enzym von G. geneura konnte als Pyrrolizidinalkaloid N-oxygenierendes Enyzm als Pyrrolizidinalkaloid N-Oxygenase (PNO) identifiziert werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Arctiiden über zwei verschiedene Gruppen von Flavin-abhängigen Monooxygenasen verfügen. Die SNO von T. jacobaeae, die PNO von G. geneura und mutmaßlich auch die identifizierten Sequenzen von A. caja und A. villica gehören hier zu einer Gruppe von Flavin-abhängigen Monooxygenasen den PNOs, die für die Entgiftung von PAs die zentrale Rolle spielen. Die Funktion der potentiell zweiten Gruppe von FMOs ist bislang nicht bekannt.Plants which synthesize pyrrolizidinalkaloids (PAs) have an effective chemical defence against non adapted herbivores. From some species of the arctiids (Lepidoptera) it is well kown that the caterpillars are feeding on PA-containing plants. These species are not only able to cope with plant derived PAs but also to accumulate them for their own defense against predators. The responsible enzym for this adaptation the Senecionine N-oxygenase (SNO) from Tyria jacobaeae (arctiid moth) was identified. The SNO a flavin-dependent monooxygenase (FMO) catalyses the formation of the non-toxic PA N-oxides from the protoxic tertiary PAs. After comparison of cDNA clones other kown FMOs from insect with the SNO from T. jacobaeae degenerated primers were constructed. From probes of the arctiids Grammia geneura, Arctia caja and Arctia villica some cDNA clones could be identified which have a high sequence conformity to other flavin-dependent monooxygenases. The identified cDNA clones could divided into two groups. The cDNA clone which was identified from G. genuera has a high conformity to the SNO from T. jacobaeae. The identified cDNA clone from G. geneura was expressed heterologous in E. coli. For the measurement of enzymatic activity an enzymatic test system with the radioactiv labelled PA Senecionine was established. The testing of the expressed protein shows the PA N-oxide formation from tertiäry PA. Thus the heterologous expressed enzyme from G. geneuera is an pyrrolizidine alkaloid N-oxygenating enzyme further called as pyrrolizidine alkaloid N-oxygenase (PNO). Presumably the arctiid moths have two groups of FMOs. The SNO from T. jacobaeae, the PNO from G. genuera and presumably the cDNA clones form A. caja and A. villica belong to a group of FMOs called the pyrrolizidine alkaloid N-oxygenases (PNOs) which are basically responsible for the detoxification of protoxic PAs. The function of the supposed second group of FMOs remains unkown

Flavin-Dependent Monooxygenases as a Detoxification Mechanism in Insects: New Insights from the Arctiids (Lepidoptera)

Insects experience a wide array of chemical pressures from plant allelochemicals and pesticides and have developed several effective counterstrategies to cope with such toxins. Among these, cytochrome P450 monooxygenases are crucial in plant-insect interactions. Flavin-dependent monooxygenases (FMOs) seem not to play a central role in xenobiotic detoxification in insects, in contrast to mammals. However, the previously identified senecionine N-oxygenase of the arctiid moth Tyria jacobaeae (Lepidoptera) indicates that FMOs have been recruited during the adaptation of this insect to plants that accumulate toxic pyrrolizidine alkaloids. Identification of related FMO-like sequences of various arctiids and other Lepidoptera and their combination with expressed sequence tag (EST) data and sequences emerging from the Bombyx mori genome project show that FMOs in Lepidoptera form a gene family with three members (FMO1 to FMO3). Phylogenetic analyses suggest that FMO3 is only distantly related to lepidopteran FMO1 and FMO2 that originated from a more recent gene duplication event. Within the FMO1 gene cluster, an additional gene duplication early in the arctiid lineage provided the basis for the evolution of the highly specific biochemical, physiological, and behavioral adaptations of these butterflies to pyrrolizidine-alkaloid-producing plants. The genes encoding pyrrolizidine-alkaloid-N-oxygenizing enzymes (PNOs) are transcribed in the fat body and the head of the larvae. An N-terminal signal peptide mediates the transport of the soluble proteins into the hemolymph where PNOs efficiently convert pro-toxic pyrrolizidine alkaloids into their non-toxic N-oxide derivatives. Heterologous expression of a PNO of the generalist arctiid Grammia geneura produced an N-oxygenizing enzyme that shows noticeably expanded substrate specificity compared with the related enzyme of the specialist Tyria jacobaeae. The data about the evolution of FMOs within lepidopteran insects and the functional characterization of a further member of this enzyme family shed light on this almost uncharacterized detoxification system in insects