Low-density lipoproteins (LDL) are circulating inhibitors of the pro-coagulant activity of tissue factor

Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se cuentan entre los inhibidores circulantes de la actividad procoagulante del factor tisular. El objetivo del trabajo fue explorar el comportamiento electroforético de las proteínas involucradas y la cinética de inhibición que permitieran desarrollar un ensayo cuantitativo in vitro capaz de poner en evidencia dicha capacidad. El ensayo cinético consistió en incubar tromboplastina cálcica comercial a 37 ºC con volúmenes crecientes de LDL aislada por precipitación selectiva redisuelta; se realizó a distintos tiempos el tiempo de protrombina en una etapa; se calcularon las actividades respectivas y el porcentaje de inhibición de la coagulabilidad respecto a un blanco. Los resultados muestran inhibición creciente hasta los 60 min en el intervalo entre 0,013 y 0,026 nmol de apoB, parámetros que definen las condiciones seleccionadas del ensayo que aplicado sobre 30 muestras de personas normolipémicas de ambos sexos (edades entre 30 y 70 años) presentó una media +/- SEM de 2.512 +/- 101,4 expresadas en porcentaje de inhibición de la coagulabilidad / nmol de apoB, hallando diferencia significativa en la condición diabética. El comportamiento electroforético, evaluado a tiempo cero mostró dos bandas pre-beta y beta, atribuibles a la tromboplastina y a la LDL respectivamente; en tanto que luego de incubar 60 min se observó una única banda intensificada de migración pre-beta que se podría atribuir a la presencia del complejo LDL - factor tisular. Son necesarios estudios clínicos que permitan evaluar los alcances de aplicación de los ensayos propuestos.Low-density lipoproteins (LDL) are circulating inhibitors of the pro-coagulant activity of tissue factor. The objective of the present work was to explore the electrophoretic mobility of the involved proteins and the kinetic of pro - coagulant activity inhibition, that allow us to propose a quantitative in vitro assay of potential clinical use. For the kinetic assay, commercial calcic thromboplastine was incubated with increasing volumes of redisolved - selectively precipitated LDL at 37 ºC. Then the prothrombine time in one step was made; the inhibitory activity and percentage of inhibition against a blank were calculated. The results show an increasing inhibition of procoagulant activity until 60 min between 0.013 – 0.026 nmol apoB. The conditions for the assay of 30 samples of normolipemic individuals (ages between 30 – 70 years old) were selected on the basis of these results. The assay of % coagulation inhibition / nmol apoB showed signficative differences for control group versus diabetic one. The protein electrophoresis showed two bands in pre-beta and beta positions corresponding to thromboplastine and LDL respectively at time zero. After 60 min of incubation one intense band corresponding to LDL – tissue factor complex can be observed. This work proposes a simple assay for the evaluation of LDL role in haemostatic control in pathological conditions, although further clinical assays are still required.Facultad de Ciencias Exacta

A simple method to assess the oxidative susceptibility of low density lipoproteins

Background: Oxidative modification of low density lipoproteins (LDL) is recognized as one of the major processes involved in atherogenesis. The in vitro standardized measurement of LDL oxidative susceptibility could thus be of clinical significance. The aim of the present study was to establish a method which would allow the evaluation of oxidative susceptibility of LDL in the general clinical laboratory. Results: LDL was isolated from human plasma by selective precipitation with amphipathic polymers. The ability of LDL to form peroxides was assessed by measuring thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) after incubation with Cu2+ and H2O2. Reaction kinetics showed a three-phase pattern (latency, propagation and decomposition phases) which allowed us to select 150 min as the time point to stop the incubation by cooling and EDTA addition. The mixture Cu 2+/H2O2 yielded more lipoperoxides than each one on its own at the same time end-point. Induced peroxidation was measured in normal subjects and in type 2 diabetic patients. In the control group, results were 21.7 ± 1.5 nmol MDA/mg LDL protein, while in the diabetic group results were significantly increased (39.0 ± 3.0 nmol MDA/mg LDL protein; p < 0.001). Conclusion: a simple and useful method is presented for the routine determination of LDL susceptibility to peroxidation in a clinical laboratory.Facultad de Ciencias Exacta

Modification of low-density lipoproteins in diabetic patients

En los pacientes diabéticos, las lipoproteínas presentan frecuentemente cambios cualitativos y cuantitativos en su composición y varios pasos del metabolismo están alterados. Estas anormalidades contribuyen al incremento del riesgo de enfermedad cardiovascular y se la conoce como “dislipemia aterogénica”. En este trabajo se estudiaron en una población de pacientes diabéticos las modificaciones fisicoquímicas por glicación de sus lipoproteínas de baja densidad (LDL), los resultados se compararon con una población control y con ensayos de glicación in vitro. Las LDL se aislaron por precipitación selectiva y las modificaciones se evaluaron por el incremento de fructosamina, el consumo de los residuos e-amino de lisina, guanidinio de arginina y la disminución de la fluorescencia del grupo indol del triptofano. Los procedimientos seleccionados resultan accesibles al laboratorio clínico. Los valores medios para todos los analitos medidos fueron significativamente diferentes de los de la población control (p<0,0001); de la comparación del ensayo in vitro pudo deducirse que las alteraciones de los residuos de arginina serían un marcador temprano de las modificaciones por glicación, en tanto que las producidas en los residuos de lisina y triptofano representarían indicadores de las alteraciones de mediano plazo. Vale considerar la utilidad de evaluar simultáneamente en una misma molécula, indicadores de control glucémico tanto de corto como de mediano plazo, teniendo en cuenta su relevancia en la fisiopatología de la ateroesclerosis.In diabetic patients, lipoproteins usually show qualitative and quantitative changes in their composition and as a consequence, several metabolic pathways are altered. These alterations contribute to an increase in the risk of cardiovascular disease, also known as “atherogenic dyslipidemia”. The present workstudied the physicochemical modifications by glycation of low density lipoproteins (LDL) in a population of diabetic patients. The results were compared with a control population and with the results obtained from an in vitro glycation assay. LDL were isolated byselective precipitation and the modifications were assessed by the increase in fructosamine level, the decrease of e-amino group of lysine, guanidinio of arginine and indol fluorescence of tryptophan residues. The select methods are available for clinical laboratories. The mean valúes for all the measured analytes were signi- ficantly different from those obtained for the control population (p&lt; 0.0001). Taking into account the results of the in vitro kinetics assays, it can be assumed that the modifications of the arginine residues would be an early glycation marker while the changes in the lysine and triptophan residues may be considered middle term alterations. It is worth remarking the usefulness of evaluating, early and middle term indicators ofglycaemic control simultaneously in the same molecule. These findings are relevant for the pathophysiology of athero- genesis.Facultad de Ciencias Exacta

Modification of low-density lipoproteins in diabetic patients

En los pacientes diabéticos, las lipoproteínas presentan frecuentemente cambios cualitativos y cuantitativos en su composición y varios pasos del metabolismo están alterados. Estas anormalidades contribuyen al incremento del riesgo de enfermedad cardiovascular y se la conoce como “dislipemia aterogénica”. En este trabajo se estudiaron en una población de pacientes diabéticos las modificaciones fisicoquímicas por glicación de sus lipoproteínas de baja densidad (LDL), los resultados se compararon con una población control y con ensayos de glicación in vitro. Las LDL se aislaron por precipitación selectiva y las modificaciones se evaluaron por el incremento de fructosamina, el consumo de los residuos e-amino de lisina, guanidinio de arginina y la disminución de la fluorescencia del grupo indol del triptofano. Los procedimientos seleccionados resultan accesibles al laboratorio clínico. Los valores medios para todos los analitos medidos fueron significativamente diferentes de los de la población control (p<0,0001); de la comparación del ensayo in vitro pudo deducirse que las alteraciones de los residuos de arginina serían un marcador temprano de las modificaciones por glicación, en tanto que las producidas en los residuos de lisina y triptofano representarían indicadores de las alteraciones de mediano plazo. Vale considerar la utilidad de evaluar simultáneamente en una misma molécula, indicadores de control glucémico tanto de corto como de mediano plazo, teniendo en cuenta su relevancia en la fisiopatología de la ateroesclerosis.In diabetic patients, lipoproteins usually show qualitative and quantitative changes in their composition and as a consequence, several metabolic pathways are altered. These alterations contribute to an increase in the risk of cardiovascular disease, also known as “atherogenic dyslipidemia”. The present workstudied the physicochemical modifications by glycation of low density lipoproteins (LDL) in a population of diabetic patients. The results were compared with a control population and with the results obtained from an in vitro glycation assay. LDL were isolated byselective precipitation and the modifications were assessed by the increase in fructosamine level, the decrease of e-amino group of lysine, guanidinio of arginine and indol fluorescence of tryptophan residues. The select methods are available for clinical laboratories. The mean valúes for all the measured analytes were signi- ficantly different from those obtained for the control population (p&lt; 0.0001). Taking into account the results of the in vitro kinetics assays, it can be assumed that the modifications of the arginine residues would be an early glycation marker while the changes in the lysine and triptophan residues may be considered middle term alterations. It is worth remarking the usefulness of evaluating, early and middle term indicators ofglycaemic control simultaneously in the same molecule. These findings are relevant for the pathophysiology of athero- genesis.Facultad de Ciencias Exacta

In vitro glycation of low-density lipoproteins and atherogenicity in cell culture

La hiperglucemia sostenida incrementa la glicación de proteínas. En particular, las modificaciones en las lipoproteínas de baja densidad (LDL) aumentan su potencial aterogénico. En este trabajo se comparan las modificaciones producidas por la glicación in vitro de LDL aisladas por dos métodos: precipitación selectiva (PS) y ultracentrifugación (UC). Para ello, se determinó el incremento de fructosamina, el consumo de los grupos ε-amino de lisina, guanidinio de arginina y la disminución de residuos de triptofano. Para todos los analitos, los resultados cinéticos indicaron diferencias significativas con relación al basal (p<0,05), coincidentes para ambos métodos en el tiempo de aparición y en el porcentaje de variación. La aterogenicidad de las LDL glicadas separadas por PS fue estudiada en cultivos de macrófagos RAW 264.7 evaluando la formación de células espumosas y cuantificando la incorporación de LDL por tinción de los depósitos lipídicos con Oil Red. Los resultados indican que la captación de LDL modificadas aumentó con el tiempo de incubación, siendo mayor la aterogenicidad de las LDL glicadas respecto de las nativas (p<0,001, 1 h a 37 °C). El procedimiento de PS seleccionado, accesible al laboratorio bioquímico clínico, permite evaluar las modificaciones por glicación que sufren las LDL en pacientes diabéticos.Long-term hyperglycemia increases protein glycation. In particular, modifications in the low-density lipoproteins (LDL) increase their atherogenic potential. In this study, the modifications caused by in vitro glycation of LDL separated by two methods: selective precipitation (SP) and ultracentrifugation (UC) were compared. Increase fructosamine level, decrease of ε-amino group of lysine, guanidinio of arginine and triptophan fluorescence were determined. Results showed significant differences vs. basal (p<0.05) for all the tested parameters, with coincidence for the two separation methods both in time and grade of modifications. The atherogenicity of glycated LDL separated by SP was studied in macrophages RAW 264.7 in culture, through the formation of foam cells and the quantification of the dye taken up by the cellular storage lipids. Results show that the uptake of modified LDL by macrophages increased with the time of incubation, being the atherogenicity of glycated LDL greater than native LDL (p<0.001, 1 h at 37 °C). The selected SP procedure, within the facilities of routine biochemical laboratory, enables the evaluation of the modifications caused by glycation in the LDL of diabetic patients.Facultad de Ciencias Exacta

Low-density lipoproteins (LDL) are circulating inhibitors of the pro-coagulant activity of tissue factor

Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) se cuentan entre los inhibidores circulantes de la actividad procoagulante del factor tisular. El objetivo del trabajo fue explorar el comportamiento electroforético de las proteínas involucradas y la cinética de inhibición que permitieran desarrollar un ensayo cuantitativo in vitro capaz de poner en evidencia dicha capacidad. El ensayo cinético consistió en incubar tromboplastina cálcica comercial a 37 ºC con volúmenes crecientes de LDL aislada por precipitación selectiva redisuelta; se realizó a distintos tiempos el tiempo de protrombina en una etapa; se calcularon las actividades respectivas y el porcentaje de inhibición de la coagulabilidad respecto a un blanco. Los resultados muestran inhibición creciente hasta los 60 min en el intervalo entre 0,013 y 0,026 nmol de apoB, parámetros que definen las condiciones seleccionadas del ensayo que aplicado sobre 30 muestras de personas normolipémicas de ambos sexos (edades entre 30 y 70 años) presentó una media +/- SEM de 2.512 +/- 101,4 expresadas en porcentaje de inhibición de la coagulabilidad / nmol de apoB, hallando diferencia significativa en la condición diabética. El comportamiento electroforético, evaluado a tiempo cero mostró dos bandas pre-beta y beta, atribuibles a la tromboplastina y a la LDL respectivamente; en tanto que luego de incubar 60 min se observó una única banda intensificada de migración pre-beta que se podría atribuir a la presencia del complejo LDL - factor tisular. Son necesarios estudios clínicos que permitan evaluar los alcances de aplicación de los ensayos propuestos.Low-density lipoproteins (LDL) are circulating inhibitors of the pro-coagulant activity of tissue factor. The objective of the present work was to explore the electrophoretic mobility of the involved proteins and the kinetic of pro - coagulant activity inhibition, that allow us to propose a quantitative in vitro assay of potential clinical use. For the kinetic assay, commercial calcic thromboplastine was incubated with increasing volumes of redisolved - selectively precipitated LDL at 37 ºC. Then the prothrombine time in one step was made; the inhibitory activity and percentage of inhibition against a blank were calculated. The results show an increasing inhibition of procoagulant activity until 60 min between 0.013 – 0.026 nmol apoB. The conditions for the assay of 30 samples of normolipemic individuals (ages between 30 – 70 years old) were selected on the basis of these results. The assay of % coagulation inhibition / nmol apoB showed signficative differences for control group versus diabetic one. The protein electrophoresis showed two bands in pre-beta and beta positions corresponding to thromboplastine and LDL respectively at time zero. After 60 min of incubation one intense band corresponding to LDL – tissue factor complex can be observed. This work proposes a simple assay for the evaluation of LDL role in haemostatic control in pathological conditions, although further clinical assays are still required.Facultad de Ciencias Exacta

In vitro glycation of low-density lipoproteins and atherogenicity in cell culture

La hiperglucemia sostenida incrementa la glicación de proteínas. En particular, las modificaciones en las lipoproteínas de baja densidad (LDL) aumentan su potencial aterogénico. En este trabajo se comparan las modificaciones producidas por la glicación in vitro de LDL aisladas por dos métodos: precipitación selectiva (PS) y ultracentrifugación (UC). Para ello, se determinó el incremento de fructosamina, el consumo de los grupos ε-amino de lisina, guanidinio de arginina y la disminución de residuos de triptofano. Para todos los analitos, los resultados cinéticos indicaron diferencias significativas con relación al basal (p<0,05), coincidentes para ambos métodos en el tiempo de aparición y en el porcentaje de variación. La aterogenicidad de las LDL glicadas separadas por PS fue estudiada en cultivos de macrófagos RAW 264.7 evaluando la formación de células espumosas y cuantificando la incorporación de LDL por tinción de los depósitos lipídicos con Oil Red. Los resultados indican que la captación de LDL modificadas aumentó con el tiempo de incubación, siendo mayor la aterogenicidad de las LDL glicadas respecto de las nativas (p<0,001, 1 h a 37 °C). El procedimiento de PS seleccionado, accesible al laboratorio bioquímico clínico, permite evaluar las modificaciones por glicación que sufren las LDL en pacientes diabéticos.Long-term hyperglycemia increases protein glycation. In particular, modifications in the low-density lipoproteins (LDL) increase their atherogenic potential. In this study, the modifications caused by in vitro glycation of LDL separated by two methods: selective precipitation (SP) and ultracentrifugation (UC) were compared. Increase fructosamine level, decrease of ε-amino group of lysine, guanidinio of arginine and triptophan fluorescence were determined. Results showed significant differences vs. basal (p<0.05) for all the tested parameters, with coincidence for the two separation methods both in time and grade of modifications. The atherogenicity of glycated LDL separated by SP was studied in macrophages RAW 264.7 in culture, through the formation of foam cells and the quantification of the dye taken up by the cellular storage lipids. Results show that the uptake of modified LDL by macrophages increased with the time of incubation, being the atherogenicity of glycated LDL greater than native LDL (p<0.001, 1 h at 37 °C). The selected SP procedure, within the facilities of routine biochemical laboratory, enables the evaluation of the modifications caused by glycation in the LDL of diabetic patients.Facultad de Ciencias Exacta