Structural and Functional Dissection of the Chemokine Receptor CCR7

Die Rezirkulation und die gerichtete Einwanderung von Immunzellen in sekundärelymphatische Organe sind Grundvoraussetzungen für die Entwicklung einer effizientenadaptiven Immunantwort und die Aufrechterhaltung der Immunhomöostase. Dabei spielen der Chemokinrezeptor CCR7 und seine beiden Liganden, CCL19 und CCL21 eine zentraleRolle, indem sie die Wanderung von Immunzellen hin zu sekundären lymphatischen Organen massgeblich steuern. Die Stimulation von CCR7 aktiviert ein komplexes intrazelluläres Netzwerk von Signaltransduktionswegen, wodurch verschiedene zelluläre Antworten, insbesondere Zellmigration, ausgelöst werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Struktur und die Funktion von CCR7 eingehend untersucht. Dabei lag ein spezielles Augenmerk auf der Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion und der Ligandeninduzierten Rezeptor-Endozytose/ Recycling, auch als Rezeptor trafficking bekannt.Mittels proteinbiochemischer Analysen konnte gezeigt werden, dass CCR7 konstitutivubiquitinyliert vorliegt. Weitere Untersuchungen ergaben, dass diese Rezeptormodifikation den kontinuierlichen turn-over des Chemokinrezeptors steuert. Zudem wurde eine bislang unbekannte Funktion der Rezeptorubiquitinylierung entdeckt, welche die Re-Expression von CCR7 nach vorausgehender Liganden-vermittelten Internalisierung reguliert.Mit Hilfe von Rezeptormutanten wurden die Zusammenhänge zwischen Rezeptorstrukturund Funktion untersucht. Dabei konnten drei unterschiedliche intrazelluläre Motive definiert werden, die eine wichtige Rolle bei der Liganden-induzierten G-Protein Aktivierung spielen. Weitere Untersuchungen ergaben, dass Liganden-vermitteltes Rezeptor trafficking einen GProtein unabhängigen Prozess darstellt, der bemerkenswerterweise nicht vom C-Terminusdes Rezeptors abhängt.Um neue CCR7-induzierte Signaltransduktionswege zu identifizieren, wurde die LigandeninduzierteTyrosinphosphorylierung von CCR7 untersucht. Dabei konnte gezeigt werden,dass CCR7 nach der Bindung des Liganden stark an Tyrosinresten phosphoryliert wurde,was die Rekrutierung und Aktivierung der Tyrosinphosphatase SHP2 zur Folge hatte.Funktionelle Analysen liessen eine wichtige Rolle für SHP2 in der Regulation der CCR7-vermittelten Signalübertragung erkennen, welche einen Einfluss auf die Rezeptor-vermittelte Zell-Migration und Proliferation zeigten.Da Zellen in der Regel einer Vielzahl von unterschiedlichen externen Stimuli ausgesetzt sind,ist es nicht unüblich, dass mehrere Oberflächenrezeptoren parallel aktiviert werden. Dabei können Signaltransduktionswege unterschiedlicher Rezeptoren einander beeinflussen und somit die rezeptorspezifische zelluläre Antwort modifizieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss der T-Zell-Rezeptor Aktivierung auf die CCR7-vermittelte Migration von primären humanen T-Zellen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des T-Zell Rezeptors eine verbesserte CCR7-induzierte Migration zur Folge hatte, welche durch die unterschiedliche Aktivität der Src-Kinasen Lck und Fyn hervorgerufen wurde.Diese Arbeit liefert neue Erkenntnisse über den Chemokinrezeptor CCR7, welche helfen dieFunktion und Regulation dieses wichtigen immunregulatorischen Rezeptors besser zuverstehen.<br /

Regulation of nuclear envelope permeability in cell death and survival

The nuclear pore complex (NPC) mediates macromolecular exchange between nucleus and cytoplasm. It is a regulated channel whose functional properties are modulated in response to the physiological status of the cell. Identifying the factors responsible for regulating NPC activity is crucial to understand how intracellular signaling cues are integrated at the level of this channel to control nucleocytoplasmic trafficking. For proteins lacking active translocation signals the NPC acts as a molecular sieve limiting passage across the nuclear envelope (NE) to proteins with a MW below ~40 kD. Here, we investigate how this permeability barrier is altered in paradigms of cell death and cell survival, i.e., apoptosis induction via staurosporine, and enhanced viability via overexpression of Bcl-2. We monitor dynamic changes of the NPC's size-exclusion limit for passive diffusion by confocal time-lapse microscopy of cells undergoing apoptosis, and use different diffusion markers to determine how Bcl-2 expression affects steady-state NE permeability. We show that staurosporine triggers an immediate and gradual leakiness of the NE preceding the appearance of apoptotic hallmarks. Bcl-2 expression leads to a constitutive increase in NE permeability, and its localization at the NE is sufficient for the effect, evincing a functional role for Bcl-2 at the nuclear membrane. In both settings, NPC leakiness correlates with reduced Ca²⁺ in internal stores, as demonstrated by fluorometric measurements of ER/NE Ca²⁺ levels. By comparing two cellular models with opposite outcome these data pinpoint ER/NE Ca²⁺ as a general and physiologically relevant regulator of the permeability barrier function of the NPC

Ubiquitylation of the chemokine receptor CCR7 enables efficient receptor recycling and cell migration

The chemokine receptor CCR7 is essential for lymphocyte and dendritic cell homing to secondary lymphoid organs. Owing to the ability to induce directional migration, CCR7 and its ligands CCL19 and CCL21 are pivotal for the regulation of the immune system. Here, we identify a novel function for receptor ubiquitylation in the regulation of the trafficking process of this G-protein-coupled seven transmembrane receptor. We discovered that CCR7 is ubiquitylated in a constitutive, ligand-independent manner and that receptor ubiquitylation regulates the basal trafficking of CCR7 in the absence of chemokine. Upon CCL19 binding, we show that internalized CCR7 recycles back to the plasma membrane via the trans-Golgi network. An ubiquitylation-deficient CCR7 mutant internalized normally after ligand binding, but inefficiently recycled in immune cells and was transiently retarded in the trans-Golgi network compartment of HEK293 transfectants. Finally, we demonstrate that the lack of CCR7 ubiquitylation profoundly impairs immune cell migration. Our results provide evidence for a novel function of receptor ubiquitylation in the regulation of CCR7 recycling and immunecell migration