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Innovative Vascular Prostheses Combining 3D Electrospun Nanofiber Matrices and Bioactive Coatings Prepared by Plasma-Polymerization
Malgré des efforts indéniables, l’élaboration de prothèses vasculaires (VGs) de petit diamètre (6 mm) pour le remplacement de vaisseaux occlus ou la déviation du flux sanguin (bypass) se heurte encore à des résultats mitigés. Parmi les principaux requis d’un greffon vasculaire synthétique de petit diamètre (SDVG) et pour l'ingénierie tissulaire de vaisseaux sanguins, citons l’hémocompatibilité et la compliance mécanique. En particulier, il est essentiel d’assurer la formation d’une monocouche continue de cellules endothéliales (ECs) à l’intérieur de la lumière, qui résiste aux contraintes de cisaillement physiologiques. Pour ce faire, une approche classique consiste à ensemencer la lumière du greffon avec des ECs, antérieurement à l’intervention. Néanmoins, une faible rétention des cellules sous flux sanguin, et la morphologie des textiles conventionnels constituent des freins à la formation de la monocouche. Les matériaux électrofilés permettent d’améliorer la conformité du greffon, et reproduisent plus fidèlement la morphologie de la matrice extracellulaire des vaisseaux sanguins ; ils présentent cependant le même problème de rétention et croissance des ECs. Dans cette recherche, il a été démontré qu’un tapis de nanofibres de PET électrofilées (ePET), organisées de façon aléatoire, et subséquemment recouvert d’une couche mince de polymère-plasma riche en amines primaires (L-PPE:N) permet un contrôle relativement fin des propriétés structurelles et de surface, nécessaires la formation de monocouches d’ECs confluentes sur VGs. En effet, il a été démontré que ces dépôts L-PPE:N augmentent significativement l’adhésion et la croissance d’ECs, même sous contrainte d'écoulement induite par cisaillement. La rétention cellulaire se voit aussi améliorée, mais n’est cependant pas encore idéale. En outre, les couches L-PPE:N sont également thrombogènes. Pour pallier à cela, il a été proposé de greffer du sulfate de chondroïtine (CS) sur les couches L-PPE:N; le CS est connu pour empêcher l’adhérence de plaquettes ainsi que pour favoriser l’adhésion et croissance de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs). Le greffage de CS sur L-PPE:N, lui-même déposé sur tapis électrofilés a effectivement montré une forte augmentation de la colonisation en HUVEC, et une amélioration de leur rétention (résistance au détachement).
De plus, l’alignement des ECs dans la direction du flux sanguin est connu pour renforcer la rétention des cellules dans les artères. L’approche classique pour obtenir artificiellement une monocouche de cellules alignées implique un pré-conditionnement long et coûteux de l’implant dans un bioréacteur (in vitro), sous flux. Ici, nous avons testé et comparé des tapis de PET
obtenus à la fois par électrofilage aléatoire et aligné : nous avons pu observer une légère augmentation de la résistance des ECs à la contrainte de cisaillement dans le cas des fibres alignées.
Nous avons également évalué et optimisé le potentiel de ces structures électrofilées pour la media des vaisseaux naturels, qui est constituée de cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs) et de fibres de collagène alignées circonférentiellement, essentielles à la contraction, à la dilatation et au contrôle de la pression sanguine. Nous avons ainsi fabriqué des structures de ePET aligné et avons cherché à optimiser leur compliance à l’aide de trois différentes approches d’érosion (chimique) par plasma, dans le but d’approcher au mieux les propriétés mécaniques et surfaciques des vaisseaux sanguins naturels : (i) décharges corona dans l’air, à pression atmosphérique (HP ); (ii) plasma radio-fréquencé à basse pression (LP) et (iii) plasma micro-ondes, (ii) et (iii) étant utilisés soit avec de l’oxygène (O2), pur ou mélangé avec Ar, ou encore avec CF4. L’approche (iii) a notamment permis une réduction significative du module de Young après à peine 5 min. de traitement avec O2, sans endommager les fibres. De plus, les changements observés dans la composition de surface et l’amélioration drastique de la mouillabilité/capillarité en découlant ont mené à une adhésion et une croissance accrues de cellules musculaires lisses (SMCs).
Finalement, les tapis alignés ont été modifiées avec des couches bioactives, basées sur les dépôts L-PPE:N décorés de CS, ce dernier servant de plus de site d’ancrage du facteur de croissance épidermique (EGF). Nous avons pu observer que ces couches (CS-EGF) promeuvent fortement l’adhésion, la croissance et la survie des VSCMs. Ceci suggère que le dépôt de couches bioactives sur tapis électrofilés constitue un excellent moyen de produire des échafaudages pour les parties luminale et médiane des SDVGs, offrant un contrôle fin sur les propriétés structurelles, mécaniques, surfaciques et biologiques nécessaires à une endothélialisation complète et stable de l’implant.
Mot clés : prothèse vasculaire; électrofilage; nanofibres; poly(ethylene terephthalate); polymérisation plasma; érosion par plasma; revêtements bioactifs; morphologie; propriétés mécaniques; chimie de surface; endothélialisation.----------ABSTRACT
There have been considerable efforts in developing prosthetic small-diameter (below 6mm) vascular grafts (VGs) as an alternative to autologous grafts to bypass or replace occluded blood vessels. Primary requirements for functional synthetic small-diameter vascular grafts (SDVGs) or tissue engineered blood vessels are hemocompatibility and favorable compliance. Particularly critical is the formation of a continuous, stable monolayer of endothelial cells (ECs) on the lumen under physiological shear stress. To that purpose, seeding autologous ECs on the lumen side of the graft prior to implantation is commonly done. But its success is limited by low cell retention under flow and by the large pore size of conventional textiles that do not favor the formation of a continuous monolayer. Electrospinning enables one to enhance graft compliance and to mimic the morphology of the extracellular matrix of blood vessels, but EC growth and retention on electrospun mats still remain a problem. In this research, it was shown that random electrospun PET (ePET) nanofiber mat coated by primary-amine rich plasma polymer coating (L-PPE:N) lead to finely controlled structural and surface properties that are required for a confluent EC monolayer on VGs. EC adhesion, -growth, and -retention under shear-induced flow stress were shown to be increased by L-PPE:N coating. However, cell retention is still not ideal. Moreover, this underlying L-PPE:N substrate is thrombogenic. To tackle this problem, chondroitin sulfate (CS) was grafted on LP which is known to prevent platelet adhesion while promoting human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) adhesion and growth. It was observed that grafting CS on L-PPE:N coated electrospun mats could significantly enhance HUVEC adhesion, growth and their resistance to detachment.
In addition, EC alignment in the direction of blood flow in the natural arteries is known to increase the cell capability to resist detachment under shear stress. This is typically achieved by a long and resource-consuming method involving in vitro fluid flow preconditioning in a bioreactor prior to implantation. Random and aligned electrospun PET mats were fabricated as scaffolds for the luminal layer. It was observed that EC resistance to shear stress was slightly further improved when it was directed by tuning electrospun alignment.
On the other hand, the media layer of native vessels contains vascular smooth muscle cells (VSMCs) and circumferentially-aligned collagen fibres, which are essential for contraction, dilation and blood pressure control. In this research, aligned ePET mats were fabricated as scaffolds for the media layer, and three different plasma etching techniques were used to bring their mechanical and surface properties in line with those of natural blood vessels: (i) atmospheric pressure (“HP”) corona discharge in air; (ii) low-pressure radio-frequency plasma (“LP”) and (iii) microwave plasma asher, (ii) and (iii) in pure oxygen (O2), or O2 mixture with Ar or CF4. (iii) gave substantial reduction in Young's modulus after as little as 5 min. treatment in O2, without damage to the fibers. Changes in surface composition and drastic improvement in wettability/wicking were also observed, which resulted in promoting adhesion and growth of smooth muscle cells (SMCs). The aligned mats were then grafted with bioactive coatings, based on L-PPE:N coating, CS with tethered epidermal growth factor (EGF). It was found that a CS-EGF coating promoted the VSMC adhesion, growth, survival and infiltration. Our findings suggest that electrospun mats coated with bioactive coatings provides adequate scaffolds for the luminal and media side of SDVGs, with finely-controlled structural, mechanical and bioactive surface properties required for complete and stable endothelialization.
Keywords: electrospinning; nanofibers; poly(ethylene terephthalate); plasma polymerization; plasma-etching; bioactive coatings, morphology, mechanical property; surface chemistry; In vitro cell experiment; endothelialization; vascular graf
A Facile Approach for the Mass Production of Submicro/Micro Poly (Lactic Acid) Fibrous Mats and Their Cytotoxicity Test towards Neural Stem Cells
Despite many of the studies being conducted, the electrospinning of poly (lactic acid) (PLA), dissolved in its common solvents, is difficult to be continuously processed for mass production. This is due to the polymer solution droplet drying. Besides, the poor stretching capability of the polymer solution limits the production of small diameter fibers. To address these issues, we have examined the two following objectives: first, using an appropriate solvent system for the mass production of fibrous mats with fine-tunable fiber diameters; second, nontoxicity of the mats towards Neural Stem Cell (NSC). To this aim, TFA (trifluoroacetic acid) was used as a cosolvent, in a mixture with DCM (dichloromethane), and the solution viscosity, surface tension, electrical conductivity, and the continuity of the electrospinning process were compared with the solutions prepared with common single solvents. The binary solvent facilitated PLA electrospinning, resulting in a long lasting, stable electrospinning condition, due to the low surface tension and high conductivity of the binary-solvent system. The fiber diameter was tailored from nano to micro by varying effective parameters and examined by scanning electron microscopy (SEM) and image-processing software. Laminin-coated electrospun mats supported NSC expansion and spreading, as examined using AlamarBlue assay and fluorescent microscopy, respectively
A Facile Approach for the Mass Production of Submicro/Micro Poly (Lactic Acid) Fibrous Mats and Their Cytotoxicity Test towards Neural Stem Cells
Despite many of the studies being conducted, the electrospinning of poly (lactic acid) (PLA), dissolved in its common solvents, is difficult to be continuously processed for mass production. This is due to the polymer solution droplet drying. Besides, the poor stretching capability of the polymer solution limits the production of small diameter fibers. To address these issues, we have examined the two following objectives: first, using an appropriate solvent system for the mass production of fibrousmats with fine tunable fiber diameters; second, nontoxicity of the mats towards Neural Stem Cell (NSC). To this aim, TFA(trifluoroacetic acid) was used as a cosolvent, in a mixture with DCM(dichloromethane), and the solution viscosity, surface tension, electrical conductivity, and the continuity of the electrospinning process were compared with the solutions prepared with common single solvents. The binary solvent facilitated PLA electrospinning, resulting in a long lasting, stable electrospinning condition, due to the low surface tension and high conductivity of the binary-solvent system. The fiber diameter was tailored from nano to micro by varying effective parameters and examined by scanning electron microscopy (SEM) and image-processing software. Laminin-coated electrospun mats supported NSC expansion and spreading, as examined using AlamarBlue assay and fluorescent microscopy, respectively