Entwicklung molekularer Testsysteme für die pharmazeutische Forschung : Inhibition des mitrogenen Ras/Raf-Signalwegs und Validierung von PKB/Akt als potentielle Zielstruktur zur Therapie maligner Erkrankungen

Der erste Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Etablierung und Validierung eines in vitro Testsystems zur Auffindung von Substanzen, die selektiv die Interaktion der mitogenen Signalmoleküle Ras und Raf inhibieren können. Die Deregulation der Ras-Signalkaskade spielt in einer Vielzahl maligner Transformationen eine bedeutende Rolle. Daher besteht in der pharmazeutischen Forschung großes Interesse an der Auffindung von Inhibitoren, die in der Lage sind, solche proliferativen Signale zu unterbinden und möglicherweise Ras- vermittelte Malignität einzudämmen. Das im Rahmen dieser Promotionsarbeit entwickelte Testsystem zur Detektion von Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion basiert auf der intracistronischen ß-Galaktosidase Komplementation. Hierbei werden zwei sich nicht komplementierende Deletionsmutanten der ß-Galaktosidase, deren Affinität zueinander sehr niedrig ist, mit interagierenden Proteinpaaren fusioniert, wodurch es zur Ausbildung eines aktiven Enzymkomplexes kommen kann, dessen Aktivität sich über die Umwandlung eines fluorogenen Substrats nachweisen lässt. Bei Expression der interagierenden Fusionsproteine im E.coli Stamm ER2507 zeigte sich in intakten Zellen eine spezifische Komplementation der Interaktionspartner. Eine in vitro Komplementation der Fusionsproteine konnte trotz nativer Aufreinigung nicht beobachtet werden, da die Proteine im zellfreien System unter den gegebenen Versuchsbedingungen nur sehr schwach miteinander interagierten. Das zelluläre Testsystem ließe sich in dieser Form für die Wirkstoffsuche nach Inhibitoren der Ras-Raf-Proteininteraktion einsetzen. Die Evaluierung und Validierung muss aber für jedes interagierende Proteinpaar gesondert erfolgen. Der zweite Teil dieser Promotionsarbeit umfasste die Entwicklung und Charakterisierung zellulärer Systeme zur Validierung von PKB/Akt als Zielstruktur für die Entwicklung neuartiger anti-tumoraler Strategien. PKB/Akt wird in der Literatur als zentraler Mediator von zellulären Überlebenssignalen beschrieben. Zudem weisen verschiedene Tumore eine konstitutive Aktivierung und/oder eine Überexpression von PKB/Akt auf, was möglicherweise mit dem Auftreten von Chemoresistenz korreliert. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit konnte durch die Etablierung eines geeigneten zellulären Modells die Bedeutung von PKB/Akt bei der Verhinderung des Auftretens von Anoikis herausgestellt werden. Darüber hinaus gelang es erstmals, einen kausalen Zusammenhang zwischen konstitutiver Aktivierung von PKB/Akt und der Vermittlung von Chemoresistenz in vitro als auch in vivo darzulegen. Bei der molekularen Untersuchung der PKB/Akt- vermittelten Desensitivierung von Lungenkarzinomzellen gegenüber Zytostatika zeigte sich, dass PKB/Akt Chemoresistenz durch breit gefächerte Eingriffe in die apoptotischen Hauptsignalwege über eine Vielzahl von Mechanismen wie beispielsweise die verstärkte Phosphorylierung der Initiator-Caspase 9, die erhöhte Expression des anti-apoptotischen Proteins Bcl-xL oder die verlangsamte Induktion von p53 vermittelt. Die selektive Inhibition der Kinaseaktivität von PKB/Akt stellt somit einen interessanten Ansatz für neuartige therapeutische Strategien dar, die darauf abzielen, Tumorzellen, die Chemoresistenz aufgrund einer hohen intrinsischen Aktivität von PKB/Akt aufweisen, durch Applikation eines PKB/Akt-Inhibitors gegenüber Standard-Chemotherapeutika zu resensitivieren und auf diese Weise eine Vielzahl von chemoresistenten Tumoren einer Therapie zugänglich zu machen

Phase I clinical study of the recombinant antibody toxin scFv(FRP5)-ETA specific for the ErbB2/HER2 receptor in patients with advanced solid malignomas

INTRODUCTION: ScFv(FRP5)-ETA is a recombinant antibody toxin with binding specificity for ErbB2 (HER2). It consists of an N-terminal single-chain antibody fragment (scFv), genetically linked to truncated Pseudomonas exotoxin A (ETA). Potent antitumoral activity of scFv(FRP5)-ETA against ErbB2-overexpressing tumor cells was previously demonstrated in vitro and in animal models. Here we report the first systemic application of scFv(FRP5)-ETA in human cancer patients. METHODS: We have performed a phase I dose-finding study, with the objective to assess the maximum tolerated dose and the dose-limiting toxicity of intravenously injected scFv(FRP5)-ETA. Eighteen patients suffering from ErbB2-expressing metastatic breast cancers, prostate cancers, head and neck cancer, non small cell lung cancer, or transitional cell carcinoma were treated. Dose levels of 2, 4, 10, 12.5, and 20 μg/kg scFv(FRP5)-ETA were administered as five daily infusions each for two consecutive weeks. RESULTS: No hematologic, renal, and/or cardiovascular toxicities were noted in any of the patients treated. However, transient elevation of liver enzymes was observed, and considered dose limiting, in one of six patients at the maximum tolerated dose of 12.5 μg/kg, and in two of three patients at 20 μg/kg. Fifteen minutes after injection, peak concentrations of more than 100 ng/ml scFv(FRP5)-ETA were obtained at a dose of 10 μg/kg, indicating that predicted therapeutic levels of the recombinant protein can be applied without inducing toxic side effects. Induction of antibodies against scFv(FRP5)-ETA was observed 8 days after initiation of therapy in 13 patients investigated, but only in five of these patients could neutralizing activity be detected. Two patients showed stable disease and in three patients clinical signs of activity in terms of signs and symptoms were observed (all treated at doses ≥ 10 μg/kg). Disease progression occurred in 11 of the patients. CONCLUSION: Our results demonstrate that systemic therapy with scFv(FRP5)-ETA can be safely administered up to a maximum tolerated dose of 12.5 μg/kg in patients with ErbB2-expressing tumors, justifying further clinical development