Immunoexpression of androgen receptors and aromatase in testes of patient with Klinefelter's syndrome.

Klinefelter's syndrome (47, XXY) is the most common chromosome aneuploidy in men and is usually characterized by underdeveloped testes and sterility. The aim of the present study was to detect cellular distribution of androgen receptors (AR) and aromatase in testes of patient with KS. The tissue sections were processed for morphological and immunohistochemical staining. Additionally, levels of FSH, LH, PRL, estradiol, and testosterone were measured in the plasma. Morphological analysis revealed a complete absence of spermatogenesis. No germ cells were present in seminiferous tubules. In some tubules, nests of apparently degenerating Sertoli cells were found. In the interstitium, Leydig cell hyperplasia was observed. Using immunohistochemistry, nuclear AR staining was detected in Sertoli cells and peritubular cells, whereas in Leydig cells the staining was exclusively cytoplasmic. The immunostaining of aromatase was detected in the cytoplasm of Sertoli cells and Leydig cells. Increased levels of gonadotropins and decreased level of testosterone concomitantly with the cytoplasmic localization of AR in Leydig cells might contribute to the impaired testicular function in patient with KS

Aspetti molecolari della sindrome d Klinefelter: studio delle microdelezioni del cromosoma Y e polimorfismi del recettore degli androgeni

La sindrome di Klinefelter descritta per la prima volta nel 1942 da Harry F. Klinefelter, è una malattia genetica, che colpisce gli individui di sesso maschile, caratterizzata da alta statura, proporzioni del corpo eunucoide, incompleto sviluppo dei caratteri sessuali maschili primari e secondari, ginecomastia, testicoli dalle dimensioni ridotte, azoospermia ed aumento dei livelli ormonali di FSH. La sindrome è causata da un aneuploidia congenita dei cromosomi sessuali e nell’80% i pazienti presentano il cariotipo 47, XXY mentre i restanti casi hanno un più alto grado di aneuploidie, mosaicismo o strutture anormali del cromosoma X (Lanfranco et al., 2004). La prevalenza della sindrome di Klinefelter (KS) è compresa tra 1/500 e 1/1000 e viene considerata la principale causa genetica di infertilità maschile (Bojesen et al., 2003), responsabile del 10-15% delle oligospermie severe e azoospermie non ostruttive. Nei soggetti KS si verifica, infatti, la degenerazione dei tubuli seminiferi che inizia prima della pubertà e porta, nella maggior parte dei casi, alla completa ialinizzazione dei tubuli seminiferi nell’adulto, anche se in alcuni soggetti KS adulti possono essere presenti alcuni tubuli funzionali (Aksglaede et al 2006). Sebbene la maggioranza dei soggetti KS siano azoospermici e quindi sterili, sono stati descritti, in letteratura casi di oligozoospermia severa e criptozospermia in pazienti di età inferiore ai 24 anni (Forti et al, 2006). Diversamente dalle trisomie autosomiche che hanno un’origine paterna soltanto nel 10% dei casi, il cromosoma X soprannumerario dei pazienti KS origina nel 50% dei casi da una non disgiunzione paterna (Thomas and Hassold, 2003). L’ XXY di origine materna può essere causato da una non-disgiunzione durante la prima e la seconda divisione meiotica oppure durante le divisioni mitotiche precoci post zigotiche mentre si verifica lo sviluppo dello zigote. L’ XXY paterno invece, origina soltanto da errori durante la meiosi I; la non disgiunzione paterna durante la meiosis II porterebbe infatti alla formazione di zigoti XXX e XYY ( Lanfranco et al, 2004) La grande maggioranza dei casi Klinefelter con origine paterna deriva quindi da eventi di non disgiunzione durante la meiosi I, anche se sono stati descritti casi di separazione prematura dei cromatidi fratelli durante la meosi I. (Tüttelmann et al 2010) E’ stato ipotizzato che le delezioni e i riarrangiamenti del cromosoma Y potessero avere un ruolo nel mancato appaiamento dei cromosomi e indurre una maggiore frequenza degli eventi di non disgiunzione (Rajpert et al.,2011). In accordo con questa ipotesi è stato dimostrato che la microdelezione della regione AZFc (b2/b4) è associata con elevata percentuale di spermatozoi nullisomici e con disomia XY e conseguente rischio dopo ICSI della nascita di bambini 47XXY (Ferlin et al.,2007). Le microdelezioni del cromosoma Y rappresentano la causa genetica più frequente di infertilità maschile, con una prevalenza del 10-15% tra i soggetti affetti da azoospermia non ostruttiva o grave oligozoospermia (5mil sperm/ml e mai nei soggetti normozoospermici. Diversi studi hanno indagato l’incidenza delle microdelezioni del cromosoma Y nei pazienti KS. Alcuni autori hanno rilevato un’associazione tra le microdelezioni del cromosoma Y e la sindrome KS, (Mitra et al., 2006; Hadjkacem-Loukil et al., 2009; Ceylan et al., 2010, Li et al., 2015) mentre altri appaiono in contrasto con questo dato, non evidenziando alcuna associazione tra le due alterazioni genetiche (Tateno et al., 1999; Lee et al., 2000; Ambasudhan et al., 2003; Choe et al., 2007; Balkan et al., 2008; Behulova et al., 2011, Simoni et al 2008, Rajpert-De Meyts et al. 2011, Zhang et al 2013) Altro aspetto molecolare importante è l’inattivazione di uno dei due cromosomi X durante lo sviluppo in questi pazienti. In questi pazienti circa il 15% dei geni del cromosoma X sfugge alla normale inattivazione epigenetica inducendo una overespressione genica. Tale modificazione epigenetica potrebbe essere considerata la base genetica del fenotipo del Klinefelter. (Berletch et al.,2010). La grande variabilità fenotipica che si verifica in pazienti con sindrome di Klinefelter, infatti, può essere causata da diversi fattori quali polimorfismi genetici o effetti epigenetici che possono influenzare l’inattivazione del cromosoma X. Si può ipotizzare, quindi, che il fenotipo dei pz con Sindrome di Klinefelter potrebbe essere influenzato da: 1- un eccessivo dosaggio dei geni legati al cromosoma X causato da una alterata inattivazione genica (Carrel et al., 2005). 2- diverso grado di mosaicismo 46,XY 3- origine parentale del cromosoma X soprannumerario (Iitsuka et al.,2001) 4- funzione alterata dei geni che codificano per gli androgeni in quanto livelli subnormali portano a difetti di sviluppo testicolare (Lahlou et al., 2004). Per quanto riguarda l’ipotesi della modificazione dell’inattivazione genica è da sottolineare che alcuni autori hanno evidenziato che l’inattivazione casuale di una delle due X potrebbe mascherare il fenotipo derivante da mutazioni recessive collegate al cromosoma X (Iitsuka et al.,2001, Yoshioka et al.,1998). Nei mammiferi con più di un cromosoma X, i geni di uno dei due cromosomi X non vengono espressi: questo fenomeno è noto come inattivazione del cromosoma X e si verifica nei maschi XXY così come nelle normali femmine XX (Chow JC et al., 2005). L'inattivazione del cromosoma X è un processo biologico che consiste nella disattivazione (perdita di funzione) di uno dei due cromosomi sessuali X presenti nelle loro cellule. Tale cromosoma viene "silenziato", ovvero reso inerte dal punto di vista trascrizionale, tramite impacchettamento in un'unità densa di eterocromatina a formare una struttura inerte definita corpo di Barr; il risultato di tale processo è un'attenuata espressione, in tutte le cellule, dei geni portati dai cromosomi X, e dei fenotipi da essi manifestati. Il gene deputato a tale processo è XIST (X inactive specific transcript), che trascrive un RNA espresso solo dal cromosoma inattivato e che non codifica per alcuna proteina. Agisce sul centro di inattivazione dell'X (Xic, X inactivation center) e non è espresso nel maschio con cariotipo normale (46, XY). Ognuno dei due cromosomi X dei maschi con sindrome di Klinefelter hanno la medesima probabilità di venire attivati, ma non tutti i geni vengono silenziati: il 15% rimane in duplice copia biallelica (Aksglaede et al., 2006; Wikström et al .,2004) e si ipotizza che la iperespressione di questi geni sia responsabile del fenotipo della sindrome. In particolare il gene del recettore degli androgeni (AR), membro della super famiglia dei recettori nucleari, è regolato dai livelli di testosterone ed è oggetto di diversi studi genetici. Il gene AR è localizzato sul cromosoma X in posizione Xq11-12, codifica per un fattore di trascrizione ligando dipendente, e contiene una sequenza ripetuta polimorfica CAG nell’esone 1 codificante un tratto di poli-glutammina. L’estrema variabilità del numero delle ripetizioni determina la differente lunghezza del tratto nel dominio di trans-attivazione N-terminale (Zinn et al., 2005; Tirabassi et al., 2013; Francomano et al., 2013). Il numero di ripetizioni CAG può variare da 9 a 36 con variazioni tra le differenti etnie e gruppi razziali; infatti negli uomini caucasici sono presenti in media 21 ripetizioni, negli afro-Americani 18 e negli uomini asiatici 22 ripetizioni (Edwards et al., 1992). (Tirabassi et al., 2015). Nella donna quando il processo di inattivazione della X non avviene correttamente, può verificarsi l’inattivazione non randomica degli alleli per il recettore degli androgeni (AR) con conseguente aumento dell’attività degli androgeni e irsutismo e ovaie policistiche (Calvo et al.,2000; Vottero et al., 1999). Mutazioni del gene nell’uomo sono associate a vari disordini tra cui la sindrome dell’insensibilità completa agli androgeni (Sills et al.,2002), disturbi dei neuroni motori e cancro della prostata (MacLean et al.,1995). È stata dimostrata una relazione inversa tra il numero di ripetizioni nel tratto CAG e la trascrizione della proteina AR: sequenza più lunghe sono associate a una ridotta capacità trascrizionale con conseguente riduzione del meccanismo del feedback androgeno dipendente (Bogaert et al., 2009). Diversi possono essere i target sotto il controllo del recettore degli androgeni in uomini eugonadici: dimensione della prostata (Giovannucci et al.,1999), concentrazione dei lipidi, dell’insulina e della leptina (Zitzmann et al., 2003), funzioni endoteliali (Zitzmann et al.,2001), densità dell’osso (Zitzmann et al., 2001; Chen et al., 2003), sviluppo cognitivo (Seidman et al., 2001; Harkonen et al., 2003) e concentrazione degli spermatozoi (Von Eckardstein et al.,2001). Il rischio di insorgenza del cancro alla prostata risulta aumentato in pazienti con ripetizioni più corte (Ntais et al., 2003). Alla luce di tutto ciò scopo della mia tesi è stato quello di svolgere uno studio molecolare su pazienti affetti da Sindrome di Klinefelter, ed in particolare: 1- STUDIO 1 - identificare l’incidenza delle microdelezioni del cromosoma Y in pazienti con Sindome di Klinefelter nella popolazione caucasica al fine di determinare se tale delezione possa aumentare il rischio di aneuploidie cromosomiche e possa avere un impatto nella gestione e nello screening genetico di questi pazienti. Al fine di valutare l’entità di tale alterazione genica nei KS abbiamo confrontato l’incidenza delle microdelezioni del cromosoma Y in pazienti KS rispetto ai pazienti con azoospermia non ostruttiva (NOA). 2- STUDIO 2 – analizzare la lunghezza delle ripetizioni CAG e se la variazione di tale polimorfismo possa influenzare il diverso fenotipo in tale sindrom

Androgen receptor (AR)-CAG trinucleotide repeat length and idiopathic male infertility

CAG trinucleotide repeats in androgen receptor (AR) gene encode a polyglutamine tract in AR N-terminal transactivation domain. Studies have been conducted to evaluate the effect of CAG repeat length on male infertility, which have yielded contradictory results. This study aimed to explore the number of AR-CAG repeats in 150 fertile controls and 150 idiopathic infertile men, divided into four azoospermia, oligozoospermia, asthenozoospermia, and teratozoospermia subgroups. In addition, a meta-analysis was conducted based on previous studies to assess the association of the mentioned variation with male infertility in recent years. Polymerase chain reaction (PCR) targeting followed by an electrophoresis on polyacrylamide gel was used for AR-CAG genotype detecting. Moreover, a systematic search was performed in PubMed, Web of Science, Science Direct, and Google Scholar databases to collect eligible studies for meta-analysis purpose. According to the results, a significant association was observed between increased length of AR-CAG polymorphism and male infertility (p< 0.0001). Furthermore, there were similar significant associations in the azoospermia (p= 0.048), asthenozoospermia (p= 0.013) and teratozoospermia (p= 0.002) subgroups. In addition, meta-analysis on forty studies showed a significant association between AR-CAG polymorphism in the overall analysis (SMD= 0.199, 95 % CI= 0.112-0.287, p<0.001) and the Caucasian subgroup (SMD= 0.151, 95 % CI= 0.040-0.263, p= 0.008). Our results elucidated that long stretches of CAG repeat might lead to AR dysfunction, contributing to male infertility especially in the Caucasian population

Identification of small regions of overlap from copy number variable regions in patients with hypospadias

Hypospadias is a common form of congenital atypical sex development that is often associated with other congenital comorbidities. Many genes have been associated with the condition, most commonly single sequence variations. Further investigations of recurrent and overlapping copy number variations (CNVs) have resulted in the identification of genes and chromosome regions associated with various conditions, including differences of sex development (DSD). In this retrospective study, we investigated the DECIPHER database, as well as an internal institutional database, to identify small recurrent CNVs among individuals with isolated and syndromic hypospadias. We further investigated these overlapping recurrent CNVs to identify 75 smallest regions of overlap (SROs) on 18 chromosomes. Some of the genes within these SROs may be considered potential candidate genes for the etiology of hypospadias and, occasionally, additional comorbid phenotypes. This study also investigates for the first time additional common phenotypes among individuals with hypospadias and overlapping CNVs. This study provides data that may aid genetic counseling and management of individuals with hypospadias, as well as improve understanding of its underlying genetic etiology and human genital development overall

Polymorphisms of androgens-related genes and idiopathic male infertility in Turkish men

Androgens, testosterone and dihydrotestosterone (DHT) are endocrine regulators of spermatogenesis and act via androgen receptor (AR). The aim of this study was to investigate the association(s) of AR (CAG repeat length), SRD5A2 (rs523349, V89L) and TNF-α (rs1800629, -308G/A) polymorphisms with idiopathic male infertility in Turkish men. This case-control study consisted of 312 men with idiopathic infertility and 113 fertile men. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) or PCR-restriction fragment length polymorphism methods were used for genotyping. The mean AR CAG repeat length was significantly longer in infertile men than in fertile men (p = 0.015). However, there was no significant association between the SRD5A2 genotypes (VV, VL and LL) and the risk of infertility (p = 0.516). The genotype frequency and allele distribution of TNF-α -308G/A polymorphism (GG, GA, AA genotypes and G, A alleles) were not associated with male infertility (p = 0.779 and p = 0.743 respectively). AR CAG repeat expansion might be one of the risk factors for idiopathic male infertility in Turkish men. Further studies investigating the association of male infertility with AR CAG, V89L and -308G/A polymorphisms are warranted to understand the possible associations among them

Testiklarnas funktion hos pubertala pojkar med Klinefelters syndrom

Klinefelter syndrome (KS) is the most frequent karyotype disorder of male reproductive function. Since its original clinical description in 1942 and the identification of its chromosomal basis 47,XXY in 1959, the typical KS phenotype has become well recognized, but the mechanisms behind the testicular degeneration process have remained unrevealed. This prospective study was undertaken to increase knowledge about testicular function in adolescent KS boys. It comprised a longitudinal follow-up of growth, pubertal development, and serum reproductive hormone levels in 14 prepubertal and pubertal KS boys. Each boy had a testicular biopsy that was analyzed with histomorphometric and immunohistochemical methods. The KS boys had sufficient testosterone levels to allow normal onset and progression of puberty. Their serum testosterone levels remained within the low-normal range throughout puberty, but from midpuberty onwards, findings like a leveling-off in testosterone and insulin-like factor 3 (INSL3) concentrations, high gonadotropin levels, and exaggerated responses to gonadotropin-releasing hormone stimulation suggest diminished testosterone secretion. We also showed that the Leydig cell differentiation marker INSL3 may serve as a novel marker for onset and normal progression of puberty in boys. In the KS boys the number of germ cells was already markedly lower at the onset of puberty. The pubertal activation of the pituitary-testicular axis accelerated germ cell depletion, and germ cell differentiation was at least partly blocked at the spermatogonium or early primary spermatocyte stages. The presence of germ cells correlated with serum reproductive hormone levels. The immature Sertoli cells were incapable of transforming to the adult type, and during puberty the degeneration of Sertoli cells increased markedly. The older KS boys displayed an evident Leydig cell hyperplasia, as well as fibrosis and hyalinization of the interstitium and peritubular connective tissue. Altered immunoexpression of the androgen receptor (AR) suggested that in KS boys during puberty a relative androgen deficiency develops at testicular level. The impact of genetic features of the supernumerary X chromosome on the KS phenotype was also studied. The present study suggests that parental origin of the supernumerary X chromosome and the length of the CAG repeat of the AR gene influence pubertal development and testicular degeneration. The current study characterized by several means the testicular degeneration process in the testes of adolescent KS boys and confirmed that this process accelerates at the onset of puberty. Although serum reproductive hormone levels indicated no hypogonadism during early puberty, the histological analyses showed an already markedly reduced fertility potential in prepubertal KS boys. Genetic features of the X chromosome affect the KS phenotype.Testiklarnas funktion hos pubertala pojkar med Klinefelters syndrom Den extra X-kromosom, som förorsakar Klinefelters syndrom (KS eller 47,XXY), är en av de viktigaste genetiska orsakerna till manlig infertilitet. En av 600 pojkar föds med denna kromosomavvikelse. KS-patienternas infertilitet beror på att sädestamcellerna försvinner. Nya behandlingsmetoder för infertilitet har dock gett denna patientgrupp en möjlighet att få egna barn, vilket tidigare ansågs omöjligt. Den degeneration av testiklarna, som sker hos KS-patienterna under puberteten, har ej undersökts systematiskt. Syftet med denna doktorsavhandling var därför att undersöka med moderna metoder för hormonbestämning och vävnadsundersökning mekanismerna bakom denna testikeldestruktion. KS-pojkarnas testosteronnivåer var under puberteten tillräckliga för att trygga en normal virilisering. Trots att stegringen i testosteronnivåerna avtog under puberteten, hölls dessa, liksom även olika markörer för androgenaktivitet på vävnadsnivå, inom normala gränser. Gonadotropinerna, som utsöndras av hypofysen och reglerar testiklarnas funktion, steg vid 13-14 års ålder klart över det normala, vilket tyder på att KS-patienterna vid denna ålder utvecklar en relativ testosteronbrist. Insulinliknande faktor-3 (INSL3) utsöndras av testiklarnas Leydig-celler. I denna undersökning mättes för första gången INSL3-nivåer hos pojkar under puberteten. Till en början steg KS-pojkarna INSL3-nivåer på samma sätt som hos normala pojkar, men senare under puberteten var KS pojkarnas INSL3-nivåer lägre än normala. Hos KS-patienter kan INSL3 därför vara ett bättre mått än testosteron på testiklarnas könshormonproduktion. Destruktionen av spermatogonierna (sädestamcellerna) började i KS-pojkarnas testiklar i början av puberteten vid den tidpunkt, då dessa normalt skall mogna till spermatocyter och då testiklarnas hormonutsöndring aktiveras. Vidare kunde konstateras, att testiklarnas Sertoli-cellers mognadsprocess var kraftig störd och att Leydig-cellernas utseende var avvikande. Avvikelser i androgenreceptorn tydde på en relativ androgenbrist hos KS-pojkarna också på testikelnivå. KS-pojkarna får den extra X-kromosomen lika ofta av mor som av far. Resultaten från denna undersökning visade, att den extra X-kromosomens ursprung samt CAG-sekvensens längd i androgenreceptorgenen på X-kromosomen påverkar KS-pojkarnas pubertetsutveckling och degenerationen av deras testiklar. Denna doktorsavhandling ger viktig ny information om den testikeldestruktion, som sker hos KS-patienterna under puberteten, samt om de förändringar i hormonnivåerna, som denna skada leder till. Vi visade att KS-patienternas fertilitet var kraftigt nedsatt redan i början av puberteten, men att deras testiklars testosteronproduktion hölls inom normala gränser under puberteten. Dessa undersökningsresultat kan användas, då man planerar en optimal uppföljning och vård för dessa patienter.Kivesten toiminta murrosikäisillä Klinefelterin oireyhtymää sairastavilla pojilla Klinefelterin oireyhtymän (KS) aiheuttama ylimääräinen X-kromosomi (l. kromosomisto 47,XXY) on tavallisin miehen lapsettomuuteen johtava kromosomipoikkeavuus. Noin joka 600. vastasyntyneeltä pojalta löytyy tällainen kromosomisto. Oireyhtymään liittyvä lapsettomuus johtuu sukusolujen häviämisestä kiveksistä, minkä vuoksi omien lasten saamista on aikaisemmin pidetty mahdottomana. Uudet, avusteiset lisääntymishoidot ovat kuitenkin muuttaneet tätä käsitystä. Koska KS-potilaiden kivesten tuhoutuminen murrosiän aikana on huonosti tunnettu, tässä väitöskirjatutkimuksessa selvitettiin modernein hormonimääritys- ja kudostutkimusmenetelmin kivesten tuhoutumiseen johtavia mekanismeja. Totesimme, että miessukupuolihormonin, testosteronin, pitoisuudet riittivät normaaliin miehistymiseen murrosiässä. Testosteronitasojen nousu hidastui murrosiän edetessä, mutta se pysyi normaalin rajoissa koko puberteetin ajan. Samoin testosteronin vaikutusta elimistössä kuvaavat mittarit olivat murrosiän aikana normaaleja. Kivesten toimintaa säätelevät aivolisäkehormonit (gonadotropiinit) kuitenkin nousivat normaalia korkeammiksi n. 13-14 vuoden iässä viitaten osittaiseen testosteronivajeeseen. Tutkimuksessa mitattiin ensimmäistä kertaa kivesperäisen insuliinikaltaisen tekijän-3:n (INSL3) pitoisuuksia murrosiän kehityksen aikana. INSL3-tasojen nousu oli murrosiän käynnistyessä samanlainen KS-pojilla kuin normaaleilla pojilla, mutta keskipuberteetista lähtien KS-poikien INSL3-tasot jäivät normaalia matalammiksi. INSL3 voi soveltua testosteronipitoisuutta herkemmin kuvaamaan sukupuolihormonien eritystä KS-potilailla. Varhaissukusolujen tuhoutuminen käynnistyi KS-poikien kiveksissä silloin, kun näiden solujen pitäisi kypsyä alkusiemensoluista varhaissiemensoluiksi. Tämä sukusolukuolema liittyi kiveksen hormonituotannon käynnistymiseen. Lisäksi KS-poikien kivesten Sertolin solut eivät kypsyneet normaalisti ja heidän Leydigin solujensa rakenne oli poikkeava. Myös androgeenireseptori poikkesi normaalista viitaten osittaiseen miessukupuolihormonin puutokseen kiveksissä. KS-pojat saavat ylimääräisen X-kromosomin yhtä usein äidiltään kuin isältään. Tässä tutkimuksessa havaittiin että ylimääräisen X-kromosomin alkuperä ja X-kromosomilla sijaitsevan androgeenireseptorigeenin CAG-toistojakson pituus vaikuttavat KS-poikien murrosikäkehitykseen ja kivesten tuhoutumiseen. Väitöskirjatutkimus tuo merkittävää uutta tietoa murrosiän aikana tapahtuvasta KS-potilaiden kivesvauriosta ja vaurioon liittyvistä hormonaalisista muutoksista. Osoitimme, että jo murrosiän alussa KS-potilaiden fertiliteetti on selvästi alentunut, mutta että kivesten testosteronieritys säilyy normaalin rajoissa murrosiässä. Tutkimustuloksia voidaan käyttää suunniteltaessa tämän potilasryhmän optimaalista seurantaa ja hoitoa