Role of CARM1 in regulation of alveolar epithelial senescence and emphysema susceptibility

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by an irreversible loss of lung function and is one of the most prevalent and severe diseases world-wide. A major feature of COPD is emphysema- a long-term, progressive condition. The hallmark of emphysema includes the destruction of alveolar structures leading to enlarged air spaces and reduced surface area. Experimental evidence suggests that emphysema development is driven by accelerated senescence of lung cells but the underlying mechanism of senescence is yet to be fully elucidated. Protein arginine methyltransferases (PRMTs) are important for cellular processes, such as the regulation of senescence, cell proliferation, differentiation and apoptosis. The PRMT family includes 11 members classified as type I, II or III enzymes depending on their methylation pattern (asymmetric dimethylation, symmetric dimethylation or monomethylation, respectively). One member of this family is PRMT4, a type I enzyme, which is also called coactivator associated arginine methyltransferase 1 (CARM1). It was originally identified as a coactivator for steroid hormone receptors. CARM1 is known to methylate histone H3 and various non-histone proteins that play essential roles in transcriptional regulation, RNA splicing, and metabolism. Most importantly, complete loss of CARM1 leads to disrupted differentiation and maturation of alveolar epithelial type-II cells (ATII). Furthermore, CARM1 also plays a role in regulating cellular senescence via CARM1-dependent methylation. Based on these reports, we hypothesized that CARM1 regulates the development and progression of emphysema. To address this, we investigated the contribution of CARM1 to alveolar rarefication using the mouse model of elastase-induced emphysema in vivo and siRNA-mediated knockdown in ATII-like LA4 cells in vitro. We monitored emphysema progression for 161 days in mice treated with a single oropharyngeal application of elastase. The progression was manifested by the decline in lung function parameters. The mean chord length (Lm) confirmed a time dependent airspace enlargement and was directly correlated with a significant increase in dynamic lung compliance. We also observed that at later time points (day 56 and 161), emphysema progression was inflammation-independent. We demonstrated that emphysema advancement was associated with a time-dependent downregulation of CARM1, specifically in alveolar epithelial cells. Furthermore, the global CARM1 activity was also reduced as reflected by an elevated level of CARM1 phosphorylation in the lung. Most importantly, elastase-treated CARM1 haploinsufficient mice showed significantly increased airspace enlargement (52.5±9.6 µm vs. 38.8±5.5 µm, p<0.01) and lung compliance (2.8±0.32 µl/cmH20 vs. 2.4±0.4 µl/cmH20, p<0.04) compared with wild type controls. Reduced CARM1 contributed to senescence of alveolar epithelial cells evident by the reduction of anti-senescence SIRT1 and the induction of senescence markers p16 and β-galactosidase in alveolar epithelial cells. We further demonstrated that CARM1 haploinsufficiency impaired trans-differentiation of ATII into ATI cells. Elastase treatment in CARM1 deficient mouse lungs led to the accumulation of SP-C positive ATII cell. In our in vitro studies, we detected that the knockdown of CARM1 in the ATII-like cell line LA-4 led to decreased SIRT1 expression (0.034±0.003 vs. 0.022±0.001, p<0.05), but increased expression of p16 (0.27±0.013 vs. 0.31±0.010, p<0.5), p21 (0.81±0.088 vs. 1.28± 0.063, p<0.01) and induced a higher number of β-galactosidase-positive senescent cells (50.57%±7.36 vs. 2.21%±0.34, p<0.001), compared with scrambled siRNA. The senescence in CARM1 deficient cells was further augmented after CSE stimulation. Furthermore, we demonstrated that CARM1 deficiency impaired wound healing (32.18%±0.9512 vs. 8.769%±1.967 wound gap closure, p<0.001) of alveolar epithelial cells. The data confirmed that CARM1 reduction induced an accelerated senescence in LA-4 cells by attenuating the effect of SIRT1. Overall, both our in vivo and in vitro results revealed a novel function of CARM1 in regulating emphysema development and premature lung aging via alveolar senescence, as well as impaired regeneration, repair and differentiation of ATII cells.Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) zählt zu den häufigsten schweren Krankheiten weltweit und ist gekennzeichnet durch eine irreversible Abnahme der Lungenfunktion. Ein Hauptcharakteristikum von COPD ist das Emphysem, das sich stetig über einen langen Zeitraum fortschreitend entwickelt, und durch die Zerstörung alveolärer Strukturen, einhergehend mit vergrößerten Lufträumen und verringerter Alveolaroberfläche, gekennzeichnet ist. Ergebnisse aus Studien legen nahe, dass die Entwicklung des Emphysems durch die erhöhte Seneszenz von Zellen der Lunge beschleunigt wird, doch die genauen zugrundeliegenden Mechanismen sind noch nicht aufgeklärt. Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) spielen eine bedeutende Rolle bei zellulären Prozessen wie Regulation von Seneszenz, Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Die Familie der PRMTs umfasst 11 Enzyme, die als Typ I, II, oder III klassifiziert werden, abhängig von ihrem Methylierungsmuster (asymmetrische Dimethylierung, symmetrische Dimethylierung oder Monomethylierung). Ein Mitglied der Familie ist PRMT4, ein Typ I Enzym, das auch unter dem Namen Coactivator-assoziierte Arginin-Methyltransferase 1 (CARM1) bekannt ist. Ursprünglich wurde CARM1 als Coactivator für Steroid-Hormon-Rezeptoren beschrieben. CARM1 methyliert Histon 3 und verschiedene weitere Nicht-Histon Proteine, die eine wichtige Rolle für die Transkriptionsregulation, das RNA-Splicing und den Stoffwechsel spielen. Darüberhinaus führt der komplette Verlust von CARM1 zu gestörter Differenzierung und Maturation von Typ II Alveolarepithelzellen (ATII). Weiterhin ist CARM1 von Bedeutung für die Regulation von zellulärer Seneszenz mittels CARM1-abhängiger Methylierung. Auf Grundlage dieser Arbeiten wurde die Hypothese aufgestellt, dass CARM1 die Entwicklung und das Voranschreiten des Emphysems reguliert. Um dies aufzuklären, wurde die Rolle von CARM1 am Verlust der Alveolen in einem Elastase-induzierten Emphysem-Mausmodell in vivo sowie in vitro mittels siRNA knockdown in ATII-ähnlichen LA4-Zellen untersucht. Die Entwicklung und das Voranschreiten des Emphysems wurden über einen Zeitraum von 161 Tagen beobachtet. Dabei zeigte sich eine progressive Abnahme verschiedener Lungenfunktionsparameter. Die mittlere Alveolarweite bestätigte die zeitabhängige Vergrößerung des Luftraumes und war direkt mit einer signifikanten Zunahme der dynamischen Lungencompliance korreliert. Außerdem wurde an späteren Zeitpunkten (Tag 56 und 161) eine entzündungsabhängige Progression des Emphysems beobachtet. Das Voranschreiten des Emphysems war mit einer zeitabhängigen Herunterregulierung von CARM1 insbesondere in Alveolarepithelzellen assoziiert. Die Gesamtaktivität von CARM1 war ebenso reduziert, erkennbar anhand von erhöhter CARM1-Phosphorylierung in der Lunge. Weiterhin zeigten mit Elastase behandelte CARM1 haploinsuffiziente Mäuse eine signifikant erhöhte Vergrößerung des Luftraumes (52.5±9.6 µm vs. 38.8±5.5 µm, p<0.01) sowie der Lungencompliance (2.8±0.32 µl/cmH20 vs. 2.4±0.4 µl/cmH20, p<0.04) verglichen mit Wildtyp-Kontrollmäusen. Das verringerte Level an CARM1 trug zur Seneszenz von Alveolarepithelzellen bei, bestätigt durch eine Reduktion des Anti-Seneszenz-Markers SIRT1 und durch die Induktion der Seneszenz-Marker p16 und β-Galactosidase in Alveolarepithelzellen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass CARM1 Haploinsuffizienz die Transdifferenzierung von ATII zu ATI Zellen verhindert. Dabei führte die Elastase-Behandlung von CARM1-defizienten Mäusen zu einer Akkumulation von SP-C-positiven ATII-Zellen in der Lunge. Die in vitro Experimente haben gezeigt, dass der knockdown von CARM1 in ATII-ähnlichen LA4-Zellen zu einer verringerten SIRT1-Expression (0.034±0.003 vs. 0.022±0.001, p<0.05), und gleichzeitig zu einer erhöhten Expression von p16 (0.27±0.013 vs. 0.31±0.010, p<0.5), p21 (0.81±0.088 vs. 1.28± 0.063, p<0.01) führte. Weiterhin verursachte der CARM1 knockdown eine erhöhte Anzahl an β-Galactosidase-positiven seneszenten Zellen verglichen mit Kontroll-siRNA-behandelten Zellen (50.57%±7.36 vs. 2.21%±0.34, p<0.001). Die erhöhte Seneszenz in CARM1-defizienten Zellen wurde durch Stimulation mit Zigarettenrauchextrakt noch verstärkt. Weiterhin zeigte sich in den Alveolarepithelzellen eine verhinderte Wundheilung aufgrund CARM1-Defizienz (32.18%±0.9512 vs. 8.769%±1.967 Wundschließung, p<0.001). Diese Daten bestätigten, dass die Reduzierung von CARM1 eine beschleunigte Seneszenz in LA4-Zellen mittels Abschwächung von SIRT1-Effekten verursachte. Zusammenfassend zeigen die in vivo und vitro Ergebnisse eine neue Rolle von CARM1 bei der Regulierung der Emphysem-Entstehung und der vorzeitigen Lungenalterung, in erster Linie mittels Seneszenz von Alveolarepithelzellen, sowie beeinträchtigter Regenerierung, Reparatur und Differenzierung von ATII-Zellen

Role of CARM1 in regulation of alveolar epithelial senescence and emphysema susceptibility

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by an irreversible loss of lung function and is one of the most prevalent and severe diseases world-wide. A major feature of COPD is emphysema- a long-term, progressive condition. The hallmark of emphysema includes the destruction of alveolar structures leading to enlarged air spaces and reduced surface area. Experimental evidence suggests that emphysema development is driven by accelerated senescence of lung cells but the underlying mechanism of senescence is yet to be fully elucidated. Protein arginine methyltransferases (PRMTs) are important for cellular processes, such as the regulation of senescence, cell proliferation, differentiation and apoptosis. The PRMT family includes 11 members classified as type I, II or III enzymes depending on their methylation pattern (asymmetric dimethylation, symmetric dimethylation or monomethylation, respectively). One member of this family is PRMT4, a type I enzyme, which is also called coactivator associated arginine methyltransferase 1 (CARM1). It was originally identified as a coactivator for steroid hormone receptors. CARM1 is known to methylate histone H3 and various non-histone proteins that play essential roles in transcriptional regulation, RNA splicing, and metabolism. Most importantly, complete loss of CARM1 leads to disrupted differentiation and maturation of alveolar epithelial type-II cells (ATII). Furthermore, CARM1 also plays a role in regulating cellular senescence via CARM1-dependent methylation. Based on these reports, we hypothesized that CARM1 regulates the development and progression of emphysema. To address this, we investigated the contribution of CARM1 to alveolar rarefication using the mouse model of elastase-induced emphysema in vivo and siRNA-mediated knockdown in ATII-like LA4 cells in vitro. We monitored emphysema progression for 161 days in mice treated with a single oropharyngeal application of elastase. The progression was manifested by the decline in lung function parameters. The mean chord length (Lm) confirmed a time dependent airspace enlargement and was directly correlated with a significant increase in dynamic lung compliance. We also observed that at later time points (day 56 and 161), emphysema progression was inflammation-independent. We demonstrated that emphysema advancement was associated with a time-dependent downregulation of CARM1, specifically in alveolar epithelial cells. Furthermore, the global CARM1 activity was also reduced as reflected by an elevated level of CARM1 phosphorylation in the lung. Most importantly, elastase-treated CARM1 haploinsufficient mice showed significantly increased airspace enlargement (52.5±9.6 µm vs. 38.8±5.5 µm, p<0.01) and lung compliance (2.8±0.32 µl/cmH20 vs. 2.4±0.4 µl/cmH20, p<0.04) compared with wild type controls. Reduced CARM1 contributed to senescence of alveolar epithelial cells evident by the reduction of anti-senescence SIRT1 and the induction of senescence markers p16 and β-galactosidase in alveolar epithelial cells. We further demonstrated that CARM1 haploinsufficiency impaired trans-differentiation of ATII into ATI cells. Elastase treatment in CARM1 deficient mouse lungs led to the accumulation of SP-C positive ATII cell. In our in vitro studies, we detected that the knockdown of CARM1 in the ATII-like cell line LA-4 led to decreased SIRT1 expression (0.034±0.003 vs. 0.022±0.001, p<0.05), but increased expression of p16 (0.27±0.013 vs. 0.31±0.010, p<0.5), p21 (0.81±0.088 vs. 1.28± 0.063, p<0.01) and induced a higher number of β-galactosidase-positive senescent cells (50.57%±7.36 vs. 2.21%±0.34, p<0.001), compared with scrambled siRNA. The senescence in CARM1 deficient cells was further augmented after CSE stimulation. Furthermore, we demonstrated that CARM1 deficiency impaired wound healing (32.18%±0.9512 vs. 8.769%±1.967 wound gap closure, p<0.001) of alveolar epithelial cells. The data confirmed that CARM1 reduction induced an accelerated senescence in LA-4 cells by attenuating the effect of SIRT1. Overall, both our in vivo and in vitro results revealed a novel function of CARM1 in regulating emphysema development and premature lung aging via alveolar senescence, as well as impaired regeneration, repair and differentiation of ATII cells.Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) zählt zu den häufigsten schweren Krankheiten weltweit und ist gekennzeichnet durch eine irreversible Abnahme der Lungenfunktion. Ein Hauptcharakteristikum von COPD ist das Emphysem, das sich stetig über einen langen Zeitraum fortschreitend entwickelt, und durch die Zerstörung alveolärer Strukturen, einhergehend mit vergrößerten Lufträumen und verringerter Alveolaroberfläche, gekennzeichnet ist. Ergebnisse aus Studien legen nahe, dass die Entwicklung des Emphysems durch die erhöhte Seneszenz von Zellen der Lunge beschleunigt wird, doch die genauen zugrundeliegenden Mechanismen sind noch nicht aufgeklärt. Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) spielen eine bedeutende Rolle bei zellulären Prozessen wie Regulation von Seneszenz, Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Die Familie der PRMTs umfasst 11 Enzyme, die als Typ I, II, oder III klassifiziert werden, abhängig von ihrem Methylierungsmuster (asymmetrische Dimethylierung, symmetrische Dimethylierung oder Monomethylierung). Ein Mitglied der Familie ist PRMT4, ein Typ I Enzym, das auch unter dem Namen Coactivator-assoziierte Arginin-Methyltransferase 1 (CARM1) bekannt ist. Ursprünglich wurde CARM1 als Coactivator für Steroid-Hormon-Rezeptoren beschrieben. CARM1 methyliert Histon 3 und verschiedene weitere Nicht-Histon Proteine, die eine wichtige Rolle für die Transkriptionsregulation, das RNA-Splicing und den Stoffwechsel spielen. Darüberhinaus führt der komplette Verlust von CARM1 zu gestörter Differenzierung und Maturation von Typ II Alveolarepithelzellen (ATII). Weiterhin ist CARM1 von Bedeutung für die Regulation von zellulärer Seneszenz mittels CARM1-abhängiger Methylierung. Auf Grundlage dieser Arbeiten wurde die Hypothese aufgestellt, dass CARM1 die Entwicklung und das Voranschreiten des Emphysems reguliert. Um dies aufzuklären, wurde die Rolle von CARM1 am Verlust der Alveolen in einem Elastase-induzierten Emphysem-Mausmodell in vivo sowie in vitro mittels siRNA knockdown in ATII-ähnlichen LA4-Zellen untersucht. Die Entwicklung und das Voranschreiten des Emphysems wurden über einen Zeitraum von 161 Tagen beobachtet. Dabei zeigte sich eine progressive Abnahme verschiedener Lungenfunktionsparameter. Die mittlere Alveolarweite bestätigte die zeitabhängige Vergrößerung des Luftraumes und war direkt mit einer signifikanten Zunahme der dynamischen Lungencompliance korreliert. Außerdem wurde an späteren Zeitpunkten (Tag 56 und 161) eine entzündungsabhängige Progression des Emphysems beobachtet. Das Voranschreiten des Emphysems war mit einer zeitabhängigen Herunterregulierung von CARM1 insbesondere in Alveolarepithelzellen assoziiert. Die Gesamtaktivität von CARM1 war ebenso reduziert, erkennbar anhand von erhöhter CARM1-Phosphorylierung in der Lunge. Weiterhin zeigten mit Elastase behandelte CARM1 haploinsuffiziente Mäuse eine signifikant erhöhte Vergrößerung des Luftraumes (52.5±9.6 µm vs. 38.8±5.5 µm, p<0.01) sowie der Lungencompliance (2.8±0.32 µl/cmH20 vs. 2.4±0.4 µl/cmH20, p<0.04) verglichen mit Wildtyp-Kontrollmäusen. Das verringerte Level an CARM1 trug zur Seneszenz von Alveolarepithelzellen bei, bestätigt durch eine Reduktion des Anti-Seneszenz-Markers SIRT1 und durch die Induktion der Seneszenz-Marker p16 und β-Galactosidase in Alveolarepithelzellen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass CARM1 Haploinsuffizienz die Transdifferenzierung von ATII zu ATI Zellen verhindert. Dabei führte die Elastase-Behandlung von CARM1-defizienten Mäusen zu einer Akkumulation von SP-C-positiven ATII-Zellen in der Lunge. Die in vitro Experimente haben gezeigt, dass der knockdown von CARM1 in ATII-ähnlichen LA4-Zellen zu einer verringerten SIRT1-Expression (0.034±0.003 vs. 0.022±0.001, p<0.05), und gleichzeitig zu einer erhöhten Expression von p16 (0.27±0.013 vs. 0.31±0.010, p<0.5), p21 (0.81±0.088 vs. 1.28± 0.063, p<0.01) führte. Weiterhin verursachte der CARM1 knockdown eine erhöhte Anzahl an β-Galactosidase-positiven seneszenten Zellen verglichen mit Kontroll-siRNA-behandelten Zellen (50.57%±7.36 vs. 2.21%±0.34, p<0.001). Die erhöhte Seneszenz in CARM1-defizienten Zellen wurde durch Stimulation mit Zigarettenrauchextrakt noch verstärkt. Weiterhin zeigte sich in den Alveolarepithelzellen eine verhinderte Wundheilung aufgrund CARM1-Defizienz (32.18%±0.9512 vs. 8.769%±1.967 Wundschließung, p<0.001). Diese Daten bestätigten, dass die Reduzierung von CARM1 eine beschleunigte Seneszenz in LA4-Zellen mittels Abschwächung von SIRT1-Effekten verursachte. Zusammenfassend zeigen die in vivo und vitro Ergebnisse eine neue Rolle von CARM1 bei der Regulierung der Emphysem-Entstehung und der vorzeitigen Lungenalterung, in erster Linie mittels Seneszenz von Alveolarepithelzellen, sowie beeinträchtigter Regenerierung, Reparatur und Differenzierung von ATII-Zellen

Vascular Remodeling Is a Crucial Event in the Early Phase of Hepatocarcinogenesis in Rodent Models for Liver Tumorigenesis

The investigation of hepatocarcinogenesis is a major field of interest in oncology research and rodent models are commonly used to unravel the pathophysiology of onset and progression of hepatocellular carcinoma. HCC is a highly vascularized tumor and vascular remodeling is one of the hallmarks of tumor progression. To date, only a few detailed data exist about the vasculature and vascular remodeling in rodent models used for hepatocarcinogenesis. In this study, the vasculature of HCC and the preneoplastic foci of alteration (FCA) of different mouse models with varying genetic backgrounds were comprehensively characterized by using immunohistochemistry (CD31, Collagen IV, &alpha;SMA, Desmin and LYVE1) and RNA in situ hybridization (VEGF-A). Computational image analysis was performed to evaluate selected parameters including microvessel density, pericyte coverage, vessel size, intratumoral vessel distribution and architecture using the Aperio ImageScope and Definiens software programs. HCC presented with a significantly lower number of vessels, but larger vessel size and increased coverage, leading to a higher degree of maturation, whereas FCA lesions presented with a higher microvessel density and a higher amount of smaller but more immature vessels. Our results clearly demonstrate that vascular remodeling is present and crucial in early stages of experimental hepatocarcinogenesis. In addition, our detailed characterization provides a strong basis for further angiogenesis studies in these experimental models

Bridging the Species Gap: Morphological and Molecular Comparison of Feline and Human Intestinal Carcinomas

Limited availability of in vivo experimental models for invasive colorectal cancer (CRC) including metastasis and high tumor budding activity is a major problem in colorectal cancer research. In order to compare feline and human intestinal carcinomas, tumors of 49 cats were histologically subtyped, graded and further characterized according to the human WHO classification. Subsequently, feline tumors were compared to a cohort of 1004 human CRC cases. Feline intestinal tumors closely resembled the human phenotype on a histomorphological level. In both species, adenocarcinoma not otherwise specified (ANOS) was the most common WHO subtype. In cats, the second most common subtype of the colon (36.4%), serrated adenocarcinoma (SAC), was overrepresented compared to human CRC (8.7%). Mucinous adenocarcinoma (MAC) was the second most common subtype of the small intestine (12.5%). Intriguingly, feline carcinomas, particularly small intestinal, were generally of high tumor budding (Bd) status (Bd3), which is designated an independent prognostic key factor in human CRC. We also investigated the relevance of feline CTNNB1 exon 2 alterations by Sanger sequencing. In four cases of feline colonic malignancies (3 ANOS, 1 SAC), somatic missense mutations of feline CTNNB1 (p.D32G, p.D32N, p.G34R, and p.S37F) were detected, indicating that mutational alterations of the WNT/&beta;-catenin signaling pathway potentially play an essential role in feline intestinal tumorigenesis comparable to humans and dogs. These results indicate that spontaneous intestinal tumors of cats constitute a useful but so far underutilized model for human CRC. Our study provides a solid foundation for advanced comparative oncology studies and emphasizes the need for further (molecular) characterization of feline intestinal carcinomas

Comparative Study of the Role of Interepithelial Mucosal Mast Cells in the Context of Intestinal Adenoma-Carcinoma Progression

Mast cells (MCs) are crucial players in the relationship between the tumor microenvironment (TME) and cancer cells and have been shown to influence angiogenesis and progression of human colorectal cancer (CRC). However, the role of MCs in the TME is controversially discussed as either pro- or anti-tumorigenic. Genetically engineered mouse models (GEMMs) are the most frequently used in vivo models for human CRC research. In the murine intestine there are at least three different MC subtypes: interepithelial mucosal mast cells (ieMMCs), lamina proprial mucosal mast cells (lpMMCs) and connective tissue mast cells (CTMCs). Interepithelial mucosal mast cells (ieMMCs) in (pre-)neoplastic intestinal formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) specimens of mouse models (total lesions n = 274) and human patients (n = 104) were immunohistochemically identified and semiquantitatively scored. Scores were analyzed along the adenoma-carcinoma sequence in humans and 12 GEMMs of small and large intestinal cancer. The presence of ieMMCs was a common finding in intestinal adenomas and carcinomas in mice and humans. The number of ieMMCs decreased in the course of colonic adenoma-carcinoma sequence in both species (p < 0.001). However, this dynamic cellular state was not observed for small intestinal murine tumors. Furthermore, ieMMC scores were higher in GEMMs with altered Wnt signaling (active β-catenin) than in GEMMs with altered MAPK signaling and wildtypes (WT). In conclusion, we hypothesize that, besides stromal MCs (lpMMCs/CTMCs), particularly the ieMMC subset is important for onset and progression of intestinal neoplasia and may interact with the adjacent neoplastic epithelial cells in dependence on the molecular environment. Moreover, our study indicates the need for adequate GEMMs for the investigation of the intestinal immunologic TME