The long non-coding RNA Kcnq1ot1 controls maternal p57 expression in muscle cells by promoting H3K27me3 accumulation to an intragenic MyoD-binding region

BACKGROUND: The cell-cycle inhibitor p57kip2 plays a critical role in mammalian development by coordinating cell proliferation and differentiation in many cell types. p57kip2 expression is finely regulated by several epigenetic mechanisms, including paternal imprinting. Kcnq1ot1, a long non-coding RNA (LncRNA), whose gene maps to the p57Kip2 imprinting domain, is expressed exclusively from the paternal allele and participates in the cis-silencing of the neighboring imprinted genes through chromatin-level regulation. In light of our previous evidence of a functional interaction between myogenic factors and imprinting control elements in the regulation of the maternal p57Kip2 allele during muscle differentiation, we examined the possibility that also Kcnq1ot1 could play an imprinting-independent role in the control of p57Kip2 expression in muscle cells. RESULTS: We found that Kcnq1ot1 depletion by siRNA causes the upregulation of the maternal and functional p57Kip2 allele during differentiation, suggesting a previously undisclosed role for this LncRNA. Consistently, Chromatin Oligo-affinity Precipitation assays showed that Kcnq1ot1 physically interacts not only with the paternal imprinting control region of the locus, as already known, but also with both maternal and paternal alleles of a novel p57Kip2 regulatory region, located intragenically and containing two binding sites for the muscle-specific factor MyoD. Moreover, chromatin immunoprecipitation assays after Kcnq1ot1 depletion demonstrated that the LncRNA is required for the accumulation of H3K27me3, a chromatin modification catalyzed by the histone-methyl-transferase EZH2, at the maternal p57kip2 intragenic region. Finally, upon differentiation, the binding of MyoD to this region and its physical interaction with Kcnq1ot1, analyzed by ChIP and RNA immunoprecipitation assays, correlate with the loss of EZH2 and H3K27me3 from chromatin and with p57Kip2 de-repression. CONCLUSIONS: These findings highlight the existence of an imprinting-independent role of Kcnq1ot1, adding new insights into the biology of a still mysterious LncRNA. Moreover, they expand our knowledge about the molecular mechanisms underlying the tight and fine regulation of p57Kip2 during differentiation and, possibly, its aberrant silencing observed in several pathologic conditions

The PEP Survey: evidence for intense star-forming activity in the majority of radio-selected AGN at z>~1

In order to investigate the FIR properties of radio-active AGN, we have considered three different fields where both radio and FIR observations are the deepest to-date: GOODS-South, GOODS-North and the Lockman Hole. Out of a total of 92 radio-selected AGN, ~64% are found to have a counterpart in Herschel maps. The percentage is maximum in the GOODS-North (72%) and minimum (~50%) in the Lockman Hole, where FIR observations are shallower. Our study shows that in all cases FIR emission is associated to star-forming activity within the host galaxy. Such an activity can even be extremely intense, with star-forming rates as high as ~10^3-10^4 Msun/yr. AGN activity does not inhibit star formation in the host galaxy, just as on-site star-formation does not seem to affect AGN properties, at least those detected at radio wavelengths and for z>~1. Furthermore, physical properties such as the mass and age distributions of the galaxies hosting a radio-active AGN do not seem to be affected by the presence of an ongoing star-forming event. Given the very high rate of FIR detections, we stress that this refers to the majority of the sample: most radio-active AGN are associated with intense episodes of star-formation. However, the two processes proceed independently within the same galaxy, at all redshifts but in the local universe, where powerful enough radio activity reaches the necessary strength to switch off the on-site star formation. Our data also show that for z>~1 the hosts of radio-selected star-forming galaxies and AGN are indistinguishable from each other both in terms of mass and IR luminosity distributions. The two populations only differentiate in the very local universe, whereby the few AGN which are still FIR-active are found in galaxies with much higher masses and luminosities.Comment: 20 pages, 22 figures, to appear in MNRA

Circ-ZNF609 regulates G1-S progression in rhabdomyosarcoma

Circular RNAs (circRNAs) represent a class of covalently closed RNAs, derived from non-canonical splicing events, which are expressed in all eukaryotes and often conserved among different species. We previously showed that the circRNA originating from the ZNF609 locus (circ-ZNF609) acts as a crucial regulator of human primary myoblast growth: indeed, the downregulation of the circRNA, and not of its linear counterpart, strongly reduced the proliferation rate of in vitro cultured myoblasts. To deepen our knowledge about circ-ZNF609 role in cell cycle regulation, we studied its expression and function in rhabdomyosarcoma (RMS), a pediatric skeletal muscle malignancy. We found that circ-ZNF609 is upregulated in biopsies from the two major RMS subtypes, embryonal (ERMS) and alveolar (ARMS). Moreover, we discovered that in an ERMS-derived cell line circ-ZNF609 knock-down induced a specific block at the G1-S transition, a strong decrease of p-Akt protein level and an alteration of the pRb/Rb ratio. Regarding p-Akt, we were able to show that circ-ZNF609 acts by counteracting p-Akt proteasome-dependent degradation, thus working as a new regulator of cell proliferation-related pathways. As opposed to ERMS-derived cells, the circRNA depletion had no cell cycle effects in ARMS-derived cells. Since in these cells the p53 gene resulted downregulated, with a concomitant upregulation of its cell cycle-related target genes, we suggest that this could account for the lack of circ-ZNF609 effect in ARMS

Osservazione Breve Intensiva: l'esperienza dell'Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana. Analisi retrospettiva con uno sguardo al futuro.

Riassunto Introduzione: La Medicina d’Urgenza ha il compito di accettare, valutare e trattare le emergenze-urgenze; al termine di questo percorso il medico deve decidere se dimettere o ricoverare il paziente. L’Osservazione Breve Intensiva (O.B.I.), rappresenta la terza opportunità a disposizione del medico di Pronto Soccorso nella gestione delle emergenze-urgenze al fine di evitare il rischio di dimissioni o ricoveri impropri. Nel contesto attuale, caratterizzato dalla tendenza alla “deospedalizzazione” ed alla riduzione del numero di posti letto per acuti, l’O.B.I. offre un setting assistenziale alternativo al ricovero tradizionale, in grado di garantire all’utenza prestazioni qualitativamente ottimali con minore utilizzo di risorse. Circa il 5-10% dei pazienti che accedono in Pronto Soccorso necessita di osservazione; di questi mediamente il 70% viene dimesso ed il 30% ricoverato. Scopo dello studio: Valutare il corretto utilizzo dell’O.B.I. del DEA dell’Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana attraverso l’analisi degli indicatori di appropriatezza proposti dalla Società Italiana di Medicina Di Emergenza Urgenza (SIMEU), contestualizzando tale analisi nell’attuale realtà ospedaliera ed individuare possibili margini di miglioramento dell’offerta assistenziale. Metodi: L’analisi retrospettiva è stata condotta sulla popolazione di pazienti gestiti in O.B.I. dal primo gennaio 2013 al 31 dicembre 2013. Risultati: Del totale degli accessi in Pronto Soccorso, la percentuale dei pazienti afferiti all’ O.B.I. è stata dell’ 8,3%. Al termine del periodo di osservazione il 77% dei pazienti è stato dimesso ed il 21, 8% ricoverato, in linea con gli obiettivi indicati dalla SIMEU. Del restante 1,2% fanno parte i pazienti che hanno rifiutato le prestazioni contrariamente al parere medico. Le principali patologie per cui l’O.B.I. è stata attivata sono state il dolore toracico (20,3%) e il dolore addominale (16,8%), seguite in ordine decrescente dallla patologia neurologica (13,2%), dalla patologia traumatica (nel complesso 11,7%), dalla sincope (6,1%) e dall’anemia (5%). I pazienti dimessi avevano un’età significativamente più bassa rispetto ai pazienti ricoverati (p<0,001). Analizzando singolarmente le diverse patologie, possiamo affermare come soprattutto per alcuni quadri clinici, a parità di diagnosi, l’età costituisca un fattore determinante l’esito dell’osservazione. Conclusioni: L’Osservazione Breve Intensiva costituisce un’importante strumento nelle mani del medico d’urgenza al fine di garantire un corretto inquadramento diagnostico-terapeutico, di migliorare l’appropriatezza delle dimissioni e dei ricoveri e globalmente la sicurezza dell’assistenza in Pronto Soccorso

G protein–coupled receptor/arrestin3 modulation of the endocytic machinery

Nonvisual arrestins (arr) modulate G protein–coupled receptor (GPCR) desensitization and internalization and bind to both clathrin (CL) and AP-2 components of the endocytic coated pit (CP). This raises the possibility that endocytosis of some GPCRs may be a consequence of arr-induced de novo CP formation. To directly test this hypothesis, we examined the behavior of green fluorescent protein (GFP)-arr3 in live cells expressing β2-adrenergic receptors and fluorescent CL. After agonist stimulation, the diffuse GFP-arr3 signal rapidly became punctate and colocalized virtually completely with preexisting CP spots, demonstrating that activated complexes accumulate in previously formed CPs rather than nucleating new CP formation. After arr3 recruitment, CP appeared larger: electron microscopy analysis revealed an increase in both CP number and in the occurrence of clustered CPs. Mutant arr3 proteins with impaired binding to CL or AP-2 displayed reduced recruitment to CPs, but were still capable of inducing CP clustering. In contrast, though constitutively present in CPs, the COOH-terminal moiety of arr3, which contains CP binding sites but lacks receptor binding, did not induce CP clustering. Together, these results indicate that recruitment of functional arr3–GPCR complexes to CP is necessary to induce clustering. Latrunculin B or 16°C blocked CP rearrangements without affecting arr3 recruitment to CP. These results and earlier studies suggest that discrete CP zones exist on cell surfaces, each capable of supporting adjacent CPs, and that the cortical actin membrane skeleton is intimately involved with both the maintenance of existing CPs and the generation of new structures

Wall Shear Rate e Rimodellamento Carotideo: studio mediante nuova metodica Multigate Doppler

Riassunto Introduzione: Il Wall Shear Stress (WSS), ovvero il prodotto tra Wall Shear Rate (WSR) e viscosità ematica, rappresenta la forza che il flusso sanguigno esercita tangenzialmente alle pareti arteriose. E’ noto dalla letteratura sperimentale che WSS e WSR hanno importanti effetti biologici e fisiologici, tra i quali il modulare la liberazione di ossido nitrico dall’endotelio, la proliferazione delle cellule muscolari lisce nella tonaca media, e la migrazione e adesione leucocitaria. Attraverso questi meccanismi, WSS e WSR possono influenzare sia il rimodellamento arterioso associato a modificazioni emodinamiche che il processo aterosclerotico. La valutazione clinica del WSR è stata finora limitata dalla mancanza di metodiche non invasive sufficientemente accurate e praticabili per la sua determinazione. Recentemente è stata sviluppata presso l’Università di Firenze, e sottoposta a valutazione clinica preliminare presso il nostro gruppo di ricerca, una nuova metodica di ecografia vascolare basata sull’impiego simultaneo di due fasci ultrasonori (“dual beam”), uno perpendicolare al vaso per la misura di diametro e distensione arteriosa, l’altro obliquo per la registrazione del profilo di velocità di flusso ed il calcolo del WSR con approccio multigate Doppler (MGD). Oltre alla caratteristica finora unica di consentire una misura diretta e in tempo reale di WSR, grazie all’approccio dual beam tale metodica presenta alcuni ulteriori potenziali vantaggi di interesse clinico, come una prevedibile migliore accuratezza e riproducibilità della stima della velocità di flusso rispetto alla metodica convenzionale a singolo fascio (importanti principalmente per la valutazione di stenosi e restenosi arteriose, in particolare a livello carotideo). Scopo dello studio: lo studio oggetto della presente tesi ha avuto un obiettivo metodologico ed uno fisiopatologico: (a) valutare la riproducibilità della metodica dual beam per la stima del WSR; e (b) fornire un primo dataset di WSR carotideo in soggetti normali e aterosclerotici, e analizzare le possibili relazioni esistenti fra WSR, geometria e indici di rigidità arteriosa in un gruppo di soggetti normali. Metodi: La valutazione della riproducibilità della metodica per la stima del WSR è stata eseguita in un campione di 19 volontari sani. Per ogni soggetto, a livello di entrambi le carotidi comuni, sono state eseguite in rapida successione due acquisizioni Doppler, una con metodica single beam e l’altra con la tecnica dual beam. Lo studio fisiopatologico è stato condotto in 42 volontari sani (M= 15, F= 27; età media 39±14 anni; BMI= 24.4±4.45 Kg/m²; PAS= 118±12 mmHg; PAD= 70±9.4 mmHg), e in 10 pazienti con aterosclerosi carotidea senza stenosi critiche (M= 7, F= 3; età media 69.87±5.7 anni; BMI 27.74±8.34; PAS media 141.87±8.89 mmHg; PAD media 76.5±12 mmHg) . Sono stati calcolati i valori di picco sistolico e medi del WSR a livello della parete vicina e lontana del vaso, oltre che quelli di diametro e distensibilità ottenuti dall’esplorazione con fascio perpendicolare. In un sottoinsieme di 16 soggetti, diametro e distensibilità sono stati ottenuti anche con metodica ultrasonografica indipendente (Aloka SSD 5500). Risultati: (a) rispetto alla metodica convenzionale, l’approccio dual beam ha mostrato una migliore riproducibilità delle misure di WSR riferibile alla più esatta definizione dell’angolo Doppler; (b) nei soggetti normali, i valori di WSR sono risultati significativamente più elevati che nei pazienti con aterosclerosi carotidea, e hanno mostrato una correlazione inversa statisticamente significativa con l’età (r = -0.52, p < 0.0001); con lo spessore medio-intimale (r = -0.55, p < 0.0001), con il diametro (r = -0.56, p < 0.0001) e con gli indici di rigidità arteriosa (Local wave speed, LWS, r = -0.50, p < 0.002; β Stiffness index, r = -0.50, p < 0.005; modulo elastico di Peterson Ep, r = -0.52, p < 0.002). Conclusioni: la nuova metodica MGD con doppio fascio ultrasonoro mostra una riproducibilità delle misure di velocità superiore a quella convenzionale, riconducibile ad una più accurata stima dell’angolo Doppler, ed il WSR sembra svolgere un ruolo significativo nella fisiopatologia del rimodellamento carotideo età-correlato

The Phytoestrogen Quercetin Impairs Steroidogenesis and Angiogenesis in Swine Granulosa Cells In Vitro

Experimental evidence documents that nutritional phytoestrogens may interact with reproductive functions but the exact mechanism of action is still controversial. Since quercetin is one of the main flavonoids in livestock nutrition, we evaluated its possible effects on cultured swine granulosa cell proliferation, steroidogenesis, and redox status. Moreover, since angiogenesis is essential for follicle development, the effect of the flavonoid on Vascular Endothelial Growth Factor output by granulosa cells was also taken into account. Our data evidence that quercetin does not affect granulosa cell growth while it inhibits progesterone production and modifies estradiol 17β production in a dose-related manner. Additionally, the flavonoid interferes with the angiogenic process by inhibiting VEGF production as well as by altering redox status. Since steroidogenesis and angiogenesis are strictly involved in follicular development, these findings appear particularly relevant, pointing out a possible negative influence of quercetin on ovarian physiology. Therefore, the possible reproductive impact of the flavonoid should be carefully considered in animal nutrition

Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis

Circular RNAs (circRNAs) constitute a family of transcripts with unique structures and still largely unknown functions. Their biogenesis, which proceeds via a back-splicing reaction, is fairly well characterized, whereas their role in the modulation of physiologically relevant processes is still unclear. Here we performed expression profiling of circRNAs during in vitro differentiation of murine and human myoblasts, and we identified conserved species regulated in myogenesis and altered in Duchenne muscular dystrophy. A high-content functional genomic screen allowed the study of their functional role in muscle differentiation. One of them, circ-ZNF609, resulted in specifically controlling myoblast proliferation. Circ-ZNF609 contains an open reading frame spanning from the start codon, in common with the linear transcript, and terminating at an in-frame STOP codon, created upon circularization. Circ-ZNF609 is associated with heavy polysomes, and it is translated into a protein in a splicing-dependent and cap-independent manner, providing an example of a protein-coding circRNA in eukaryotes