Immobilization of a lipase activity from Aspergillus niger MYA 135 and its application in the biodiesel synthesis

Lipases have been widely used in the organic synthesis of industrially important chemicals such as emulsifiers, surfactants, wax esters, biopolymers, structured lipids, flavor-associated esters, and biodiesel. Concerning the biodiesel production, in order to get an efficient biodiesel production, the proper selection of the immobilization matrix and the subsequent reaction optimization have attracted the interest of several researches in recent years. In this work, those steps were carried out by using the one factor at a time optimization method. Thus, a culture supernatant from Aspergillus niger MYA 135 showing a lipase activity was firstly immobilized by adsorption on different low-cost supports (sand, PET and PP plastic, rubber, silicone, glass beads, silica gel and bagasse) applying a vacuum drying procedure. All biocatalysts were evaluated at 40 °C, at 800 rpm, and in the presence of different combinations of oil (soybean or waste frying oils) and alcohols (ethanol or butanol). After a three-stepwise addition of the corresponding alcohol, the biodiesel synthesis was evaluated by thin layer chromatography (TLC). The most promising reaction mixture comprised a lipase activity immobilized in silica gel as biocatalyst, and soybean oil and butanol as substrates. Then, the following parameters were analyzed: a) the enzyme concentration (1, 2, 3 and 4 ml of culture supernatant), b) the molar ratio oil:alcohol (1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7), and c) the reaction time (the addition of alcohol carried out in three equal parts every 24, 12, 6 or 3 h). In addition, the crosslinking immobilization technique was also studied. Taking into account the qualitative analysis by TLC, the best conditions for biodiesel production were: 2 ml of culture supernatant immobilized in silica, 1:4 soybean oil to butanol molar ratio, and a reaction time of 18 h. Under these optimal reaction conditions, a biodiesel yield of 93.36 % (w/w) was achieved in a solvent free system. The composition of fatty acid butyl esters was 12.97 % palmitic acid, 6.57 % estearic acid, 25.15 % oleic acid, 45.24 % linoleic acid, 4.72 % linolenic acid, 0.67 % araquidic acid, 0.34 % eicosenoic acid, and 3.83 others. Finally, it is interesting to mention that the cloud point of butyl esters is around 10 °C lower than that of methyl esters, meaning that they have better performance under cold conditions.Fil: Salvatierra, Hebe Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaFil: Baigori, Mario Domingo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaFil: Pera, Licia Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaLVI Annual Meeting Argentine Society for Biochemistry and Molecular Biology and XV Annual Meeting Argentinean Society for General MicrobiologyCiudad Autónoma de Buenos AiresArgentinaSociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología MolecularSociedad Argentina de Microbiología Genera

Iron as a multifunctional factor in aspergillus niger mya 135: fungal morphology, lipase production and lipase enhancer

Filamentous fungi have been broadly used in biotechnological processes as cell factories due to their metabolic versatility. They are able to secrete high levels of enzymes, antibiotics, vitamins, polysaccharides and organic acids. However, one particular obstacle with this kind of microorganisms focuses on their morphological form. They can show linear filaments to highly branched structures, and in submerged culture growth morphologies varying from compact pellets to dispersed mycelia. In turn, several fungal processes can be directly or indirectly affected. Those growth morphological patterns are generally induced by extracellular factors and accomplished by genetic and biochemical factors. In this connection, we previously reported that FeCl3 decreases the mycelium-bound β-N-Acetyl-D-glucosaminidase activity (a relative marker of the wall lytic potential) from Aspergillus niger ATCC MYA 135 and yields a dispersed mycelium in its presence. Here, both the fungal morphology and the lipase activity obtaining in the presence of an optimized culture medium supplemented with FeCl3 were analyzed. The role of this salt as lipase enhancer was assessed as well. Firstly, the extracellular lipase production was conducted in an orbital shaker at 30 °C during 192 h by using a mineral medium supplemented with 1 g/l FeCl3 and a final conidial concentration of about 105 conidia per ml. After 24 h of fermentation, 2 % (v/v) of olive oil was added as inducer. Thus, the highest specific activity (15.51 ± 0.78 U/mg) was obtained at 96 h of cultivation. This activity value was 10 fold compared with its control without FeCl3 supplementation. Secondly, a new fermentation of 96 h was conducted. The mycelium was examined by scanning electron microscopy displaying clumps structures with scarce ramified hyphae. The supernatant, collected by filtration, was also evaluated as biocatalyst in hydrolytic and synthetic reactions as follow. The role of iron as lipase enhancer was studied in native PAGE by using 1.3 mM of α-naphthyl acetate as substrate. Released naphthol was bound with 1 mM Fast Blue to give a colored product. Preincubation of lipase bands during 30 min in the presence of 0.1 g/l FeCl3 resulted in a significant increase of the activity signal. Additionally, the extracellular lipase activity was immobilized in silica gel by adsorption. The elemental analysis performed under SEM-EDX (Energy-dispersive X-ray spectroscopy) evidenced the presence of iron. This biocatalyst was assayed to produce biodiesel compounds in a solvent-free system using soybean oil and butanol (1:4) as substrates. After a three-stepwise addition of butanol, a biodiesel conversion of 93.36 % was reached. Therefore, it can be concluded that FeCl3 acted by altering fungal morphology, increasing lipase production and improving the performance of enzymatic activity. This research was supported by the following funding sources: FONCYT (PICT 2015-2596) CONICET (P-UE 2016-0012) and UNT (PIUNT D606).Fil: Salvatierra, Hebe Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaFil: Vázquez, Susana Claudia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Baigori, Mario Domingo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaFil: Pera, Licia Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaThe LV Annual SAIB Meeting and XIV PABMB CongressSaltaArgentinaSociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecula

Purificación a escala piloto de una actividad lipasa producida por Aspergillus niger MYA135. Caracterización cinética y molecular.

Introducción  y  Objetivos: Las  lipasas  (EC  3.1.1.3)  son enzimas  de  gran  importancia  industrial  debido  a  la heterogeneidad  de  aplicaciones  que  presentan  en  la  industria  alimenticia,  farmacéutica  y otras  y en  la producción de biocombustibles. Cada una de estas aplicaciones requiere propiedades específicas de las lipasas tales  como  especificidad,  estabilidad  térmica,  habilidad  para  catalizar  la  síntesis  de  ésteres  en  solventes orgánicos, etc. En tal sentido, este trabajo tiene como objetivo purificar una actividad lipasa a escala piloto y caracterizar el producto obtenido. Materiales  y  Métodos: Para  esto,  se  obtuvo  3  l  de  sobrenadante  de  cultivo  con  actividad  lipasa  a  partir de Aspergillus  niger MYA  135  utilizando  un  medio  salino  suplementado  con  aceite  de  oliva  (2%,  v/v).  Se optimizó el proceso de purificación. Se propuso un paso de ultrafiltración seguido de cromatografía hidrofóbica por FPLC (Fast protein liquid chromatography). Resultados: Se logró purificar una proteína con una actividad específica de 13,4 U/mg, con un rendimiento de 6,2% y un factor de purificación de 17,8. La proteína purificada reveló dos bandas en SDS-PAGE. Las mismas fueron analizadas por espectrometría de masa MS y MS/MS, dando como resultado: a) para la banda superior, una  identificación  en  MASCOT  con  Lipasa  Extracelular  de Aspergillus  niger;  Masa:  61  kDa;  pI:  4,42;  Score:110; Base de datos: NCBIprot y b) para la banda inferior una identificación con Lipasa de Aspergillus niger CBS 513.88; Masa: 31,7 kDa; pI: 4,67; Score: 5,8; Base de datos: NCBIprot. Se determinaron: el punto isoeléctrico (3,75), temperatura (30°C) y pH (7.0) óptimos, y los parámetros cinéticos Vmax (19,16 μmol/min) y Km (0,26 mM), utilizando buffer A (buffer fosfato 100 mM pH 7, goma arábiga 0,1% y tritón 0,4%), una temperatura de incubación  de  37°C  y  p-nitrofenil  palmitato  como  sustrato.  Además,  se  estudió  el  efecto  de  agentes  que modifican  aminoácidos  (5  mM):  NAI  (N-acetylimidazole),  NBS  (N-bromosuccinimide),  EDAC  (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), IA (idoacetate), DEPC (diethylpyrocarbonate), CA (citraconic anhydride) y PG (phenylglyoxal); y otros compuestos (g/l): FeCl3 1, CaCl2 0,5, ácido oleico 1, glicerol 10, aceite de oliva 20 y Tritón X100 20. Se detectó un efecto de inhibición frente a CA, NAI, PG, DEPC, CaCl2y Tritón; mientras que con el  agregado  de  FeCl3 (Ka=0,17mM)  y  ácido  oleico  (Ka=0,05mM)  se  observó  un  efecto  de  activación. Finalmente,  se  realizaron  estudios  relacionados  con  la  síntesis  de  biodiesel  utilizando  la  lipasa  purificada  e inmovilizada en silica gel por adsorción como catalizador, con aceite de soja crudo y butanol en relación (1:4). Conclusiones: Como resultado, se logró sintetizar biodiesel con éxito, pudiéndose comprobar que esta enzima tiene  la  capacidad  de  reaccionar  con  un  sustrato  natural  y  catalizar  la  transesterificación.Fil: Salvatierra, Hebe Natalia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaFil: Navarro, Agustin Andres. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Wolman, Federico Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Donamaría, Julián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Nanobiotecnología. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Nanobiotecnología; ArgentinaFil: Baigori, Mario Domingo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaFil: Pera, Licia Maria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaXV Congreso Argentino de Microbiología; V Congreso Argentino de Microbiología de Alimentos; V Congreso Latinoamericano de Microbiología de Medicamentos y Cosméticos y XIV Congreso Argentino de Microbiología GeneralCiudad Autónoma de Buenos AiresArgentinaAsociación Argentina de Microbiologí