昆虫の神経ペプチドの動態: 分泌とその作用

金沢大学理学部本総合研究(B)は、近年わが国で急速に発展してきた、昆虫の神経ペプチドホルモンの研究を飛躍的に発展させるべく、重点領域研究として申請するための準備を目的として発足されたものである。このために、3回の全体会議および5回の研究打合せ会議をもった。全体会議は、第1回会議を平成4年6月12日〜14日(東京)、第2回会議を9月25日〜27日(東京)、第3回会議を11月26日〜29日(東京)で催した。第1回会議では、各分担者の最近の研究紹介と以後の進行について議論した。第2回会議では、これからの共同研究の可能性と、現在可能な緊急課題を中心に議論した。第3回会議では重点領域研究申請の具体的方向性を論じるとともに、シンポジウム「昆虫神経ペプチドの構造、機能および動態」を、東京大学の鈴木昭憲教授を代表とする特別推進研究班と合同で開催し、本研究班以外の研究者の意見も広く取り入れる機会をもった。この後、これまでの議論を踏まえて、桜井、長澤、山下、片岡を中心に、重点領域研究の申請書の作成にあたった。このための研究打ち合せ会議は、平成4年9月4日〜7日(東京)、12月22日〜23日(名古屋)、平成5年1月22日〜25日(名古屋)、3月6日〜7日(名古屋)で行い、最終的には、桜井を申請代表者とした平成6年度発足重点領域研究「昆虫の神経ペプチドホルモンの分子特性を変態統御」の申請をするに至った。研究課題/領域番号:04354004, 研究期間(年度):1992出典：研究課題「昆虫の神経ペプチドの動態: 分泌とその作用」課題番号04354004（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-04354004/）を加工して作

昆虫の血中エクジステロイド濃度の調節機構

金沢大学理学部昆虫の脱皮は前胸腺から分泌される脱皮ホルモンにより誘導される。これまで我々は、前胸腺から分泌される脱皮ホルモンは多くの昆虫で、生物活性のない3ーデヒドロエクジソンが主体であり、これは体液中に存在する還元酵素によりエクジソンに変換され、さらに脂肪体で20ーヒドロキシエクジソンへと酸化され生理活性を示すに至ることを明らかにしてきた。しかし、この系で要となる酵素である還元酵素については、その特性、産生部位等を含めおおくが不明のままである。本研究の目的はこの酵素を精製し、もってその特性等を明らかにすることにあった。カイコ幼虫体液中の還元酵素活性が最も高い5令吐糸開始当日に、ほぼ5000匹の幼虫から体液を採取し超低温下で保存した。還元酵素の精製は以下の順序で行った。血液を緩衝液で2ー3倍希釈したのち、40ー75%飽和で硫安塩析する。沈澱を溶解、透析後DEAEーセルロ-スを用いたイオン交換クロマトグラフィ-にかけ、100mM NaClにて活性を溶出した。これをレッドセファロ-スを用いたアフィニティ-クロマトグラフィ-にてさらに精製し、ついで、ゲル瀘過カラムをもちいたFRLCにて活性分画を分取した結果、ほぼ単一の精製物を得るに至った。以上は予備実験の結果であり、現在抗体作成およびアミノ酸配列決定のための試料を得るため、保存血液を用いて大量精製の途中である。還元酵素活性は体液中にみられるものの、これが血清中に存在するのか、あるいは採血時に崩壊する血球に由来するものかは不明である。血球の崩壊を防ぎながら採血する方法のうち2種類をもちいて採取した体液から血清を分離後、保存することなくそこに含まれている酵素活性を測定した結果、酵素活性のほとんどは血清にみられ、血球にはわずかしかなかった。これは還元酵素は血清中に存在し、血球由来ではないことを示唆している。研究課題/領域番号:02640554, 研究期間(年度):1990出典：研究課題「昆虫の血中エクジステロイド濃度の調節機構」課題番号02640554（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-02640554/）を加工して作

変態時の後胚発生現象に関わる内分泌の調節機構

金沢大学理学部本研究は、当該研究者らによる、タバコスズメガの前胸腺のつくるエクジステロイドは3-デヒドロエクジソンであるとの発見に端を発した。デヒドロエクジソンはそのままでは生理活性がなく体液中の酵素によりエクジソンに還元されたのち作用を示す。このため、昆虫の前胸腺の産生するエクジステロイドの同定が急務となった。そこで、世界で広く使用されている昆虫種を含む、10種の幼虫の前胸腺を培養し、産生されたエクジステロイドを高速液体クロマトグラフィーと2種類の抗体を用いたラジオイムノアッセイを用いて同定した。その結果、カイコ、ニクバエ、ショウジョウバエ、トノサマバッタではエクジソンが主であり、アゲハ、クロアゲハ、モンシロチョウ、タバコスズメガではデヒドロエクジソンが主であり、アワヨトウとワモンゴキブリでは、その中間であった。3-デヒドロエクジソンを基質として、差ラジオイムノアッセイをもちい、体液中の3-デヒドロエクジソン還元酵素活性を調べた結果、鱗翅目の体液(カイコ、アゲハ、モンシロチョウ、アワヨトウ、タバコスズメガ)は強い活性を示した。しかし、外翅類であるトノサマバッタとワモンゴキブリでの活性は弱く、ニクバエでは酵素活性は検出されなかった。タバコスズメガ5令幼虫を用いて、酵素活性の後胚発生にともなう変動を調べたところ、活性は5令初期に高く、ワンダリング期に最低となった後、前蛹期で最大となった。この変動は、特にワンダリング期以降の体液エクジステロイド濃度の変動とよく一致した。体液中の酵素活性が最も高い時期の体液を用いて、酵素の精製を試みた。本還元酵素は分子量約30Kの単量体で、NADPHを補酵素とし、室温で安定であることがわかった。現在、NADPHを用いたアフィニティークロマトグラフィー等にての酵素精製の途中である。研究課題/領域番号:63540571, 研究期間(年度):1988出典：研究課題「変態時の後胚発生現象に関わる内分泌の調節機構」課題番号63540571（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-63540571/）を加工して作

後胚発生の内分泌調節に関わる還元酵素

金沢大学理学部昆虫の変態の内分泌調節の研究によく用いられる昆虫15種の前胸腺を培養し、その産生エクジステロイドを同定した結果、前胸腺は3カテゴリ-に分れることが判明した。すなわち、主としてエクジソンを分泌するもの(カイコ、ハエ、バッタ)、3-デヒドロエクジソンを主とするもの(タバコスズメが、アゲハ、モンシロチョウ等)、この中間のもの(オオハチミツが、ワモンゴキブリ等)である。これには目特異性はなく、種により異なるといえる。又体液中のデヒドロエクジソン還元酵素(3β-リダクタ-ゼ)活性を、5目19種について検討した結果、鱗翅目(10種)では例外なく3β-リダクタ-ゼ活性が強いのに比べ、他の4目ではいずれも相当に低い値であった。しかし、低い活性とはいえ、前胸腺が産生する3-デヒドロエクジソンを全てエクジソンに還元するに十分であることも明らかとなった。この結果、3-デヒドロエクジソン→エクジソンの系は昆虫で普遍的なものであると証明された。リダクタ-ゼの精製は現在進行中である。体液中には分子量約20000のリダクタ-ゼが少くとも2種類あり、一方はNADPHを、他方はNADPHとNADHを補酵素とする。これらは硫酸アンモニウムの飽和度を変えた塩析でかなりよく分離できる。いずれの活性も2,6-ジクロロフェノ-ル-インドフェノ-ルを用いた呈色反応で検出できるので、3-デヒドロエクジソンを用いた差次的ラジオイムノアッセイを用いなくともよく、クロマトグラフィ-による精製が促進された。現在、DEAEセルロ-ス及びブル-セファロ-スによるカラムクロマトグラフィ-が終ったところであり、近い将来、β-リダクタ-ゼが抗体作成に十分量単離できるものと期待される。研究課題/領域番号:01540592, 研究期間(年度):1989出典：研究課題「後胚発生の内分泌調節に関わる還元酵素」課題番号01540592（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-01540592/）を加工して作

昆虫の神経ペプチドホルモン: 分子と組織応答

金沢大学理学部本研究は平成6年度から平成8年度に渡る3年間実施された。神経ペプチドホルモンの発現と分泌調節及びこれらの生理作用の視点から、昆虫の変態と休眠の分子機構を探るという初期の目的は果たしつつある。インスリン族ペプチドホルモンであるボンビキシンについては、その30遺伝子コピーの発現パターンとその発現調節全領域の塩基配列決定が終了し、発現調節解析の糸口を付ける一方、ボンビキシン受容体をクローニングし、チロシンキナーゼドメインをもつインスリン受容体ホモローグであることを示した。また、アトモルレベルでの定量法を確立し、その体内動態を明らかにした。前胸腺刺激ホルモンにあっては、その体内動態を超微量で精密に測定する方法を確立し、これまでのPTTH分泌動態とは異なる知見を得、変態の内分泌支配のこれまで支配的であった理解に一石を投じた。さらに、PTTH分泌がアセチルコリン作動性神経により支配されていること、これまでのPTTH分泌臨界期は必ずしもPTTH分泌とは関連がないことを示すと共に、その作用解明の端緒としてのPTTH受容体の解明も進みつつある。更に、蛹変態の初期内分泌調節系、特にJH動態の関連で複雑な系の調節を受けており、その関連分子の動態を明らかにした。胚休眠を支配する休眠ホルモンでは、胚期および幼虫期の発現動態が休眠卵と非休眠卵産生予定個体で異なること、その作用は卵巣のトレハラーゼ遺伝子の発現調節に関わることを示す一方、食道下神経節に3クラスターを形成して存在する休眠ホルモン関連ペプチド産生細胞の機能分化と分泌部位を詳細にした。また、昆虫の近縁な綱の甲殻類の神経ペプチドホルモンの解明によりその機能相関についての理解を深めた。The present scientific research project has been carried out over 3 years from the 1996 to 1998 fiscal year. The initial objective was elucidation of the molecular mechanisms underlying insect metamorphosis and embryonic diapause in respect to the expression of neuropeptide hormones and their physiological effects and we consider to have reached the goal at an appreciable level.Bombyxin, an insulin-related neuropeptide, consists of 30 gene copies and their expression pattern in Bombyx genome and the nucleotide sequences of upstream region of all the 30 genes have been accomplished. Bombyxin receptor has also been elucidated by cDNA cloning to possess the tyrosine kinase domein similar to insulin receptor. Ultra-micro assay method of bombyxin was developed using time-resolved fluoroimmunoassay (TR-FIA) which enabled to quantify a very small amount of the hormone as low as few atto-moles and to determine the detailed changes in hemolymph bombyxin concentrations through the larval-pupal-adult period. The same method became applicable to measurement of hemolymph PTTH titer, which showed a daily secretion of PTTH even before head critical period (HCP). PTTH secretion is stimulated by a neurotransmitter, acetylcholine, indicating that acetylcholine neuron may be involved in the regulation of PTTH cells. As a part of elucidation of molecular mechanisms of PTTH stimulation of prothoracic glands, purification of PTTH receptor and elucidation of its physical properties are in progress. Expression dynamics of diapause hormone (DH) mRNA showed to be different in embryonic and larval stages of animals that are destined to produce diapausing eggs from those to produce non-diapausing eggs. One of the major DH effects was involved in the expression of trehalase gene in ovary. DH gene was expressed in 3 clusters of neurosecretory cells in suboesophageal ganglion. DH is processed and secreted from the posterior cluster while pheromone biosynthesis activating neurohormone which is processed from the same precursor molecule as DH is secreted from the anterior and middle clusters. As described above, the present research project succeeded to give fundamental knowledge on understanding the molecular mechanisms of neuropeptide hormones involved in insect metamorphosis.研究課題/領域番号:06304005, 研究期間(年度):1994 – 1996出典：研究課題「昆虫の神経ペプチドホルモン: 分子と組織応答」課題番号06304005（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-06304005/063040051996kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

バンブーボーラー休眠幼虫から見いだされた油貯蔵をする新器官の機能探索

金沢大学理工研究域熱帯域に生息するOmphisa fuscidentalis(和名タケノメイガ)はその生活環に幼虫休眠期を有する。タイ北部山岳地帯では、幼虫は9月に老熟し休眠に入り、翌年5月に蛹化するという長い休眠期間を幼虫のままで過ごす。幼虫の休眠場所は竹の節間であり、そこにタンパク性分泌物で節をまたぐように隔壁をつくる。隔壁の外側はカビなどが繁殖するものの、幼虫が存在する内側にカビなどが生えることはない。幼虫の休眠生理を研究している時、幼虫体内に新規組織を見いだした。これは一層の細胞層からなるかなり太めの管構造をしており、中には液状の脂肪酸エステルが蓄積していた。休眠環境に進入しうる現地から見いだされるカビ5種類に対する抗カビ活性を測定した結果、T. harrium他4種類に対しては、弱い抗カビ活性を示したのに対した。一方、竹の節間から採取したカビに対しては強い効果を示した。これは、幼虫が蓄積している油状物質が生息環境を防衛する上で一定の役割を果たしていることを示唆する。現在の所このカビの同定には至ってはいない。今後、現地で栽培植物上で繁殖するカビに焦点を当て、さらに種々のカビに対する抗カビ活性を測定しこの油状物質の種特異性をスクリーニングする事により、応用面での可能性を探る予定である。研究課題/領域番号:13876013, 研究期間(年度):2001 – 2002出典：「バンブーボーラー休眠幼虫から見いだされた油貯蔵をする新器官の機能探索」研究成果報告書　課題番号13876013（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））（ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-13876013/ ）を加工して作

昆虫体液中の3-デヒドロエクジソン還元酵素の動態

金沢大学理学部カイコ5令幼虫の体液から3-デヒドロエクジソン還元酵素を、5段階のカラムクロマトグラフィーをへて約5300倍に精製した。ゲル濾過及びゲル電気泳動の結果から、本酵素は分子量約42000の単量体であり、NADPHを補酵素とする。精製標品のSDS-PAGEの結果は微量の不純物を含むことを示したので、ゲルから切り出したバンドをアミノ酸配列分析および抗体作成に用いた。全アミノ酸配列は決定できなかったが酵素処理により断片化したペプチドのアミノ酸配列の分析の結果から、ヒトのアルドースリダクターゼと弱い相同性があった。これらの部分アミノ酸配列を基にプローブを設計し、カイコ5令幼虫の脂肪体からのcDNAライブラリーから本酵素遺伝子のスクリーニングを行った。2次スクリーニングでポジティブであった10クローンの塩基配列を決めたものの、目的の配列は得られていなく、現在クローニングを続行中である。各組織の粗抽出物のウェスタンブロットの結果、本酵素は、血球除去後の血清と血球に多く含まれ、ついで脂肪体が多かった。卵巣、精巣、前胸腺には少量が、また、マルピギー管、消化管にはわずかながら存在することが示されたが、皮膚と神経には存在しなかった。これらの結果は、各組織の粗抽出液の酵素活性を単位タンパク質量あたりで比較した時の結果とよく一致していた。これまで、3-デヒドロエクジソンリダクターゼの研究は、消化管に集中していたが、本研究で初めて血球での産生が示唆された。また、血清及び血球に最大含量と活性が示されたことから、本酵素は血球で産生され、血液中に放出されて作用するものと考えられる。研究課題/領域番号:05640765, 研究期間(年度):1993出典：研究課題「昆虫体液中の3-デヒドロエクジソン還元酵素の動態」課題番号05640765（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-05640765/）を加工して作

昆虫体液中の3-デヒドロエクジソン還元酵素発現の解析

金沢大学理学部3-デヒドロエクジソン還元酵素は、前胸腺が分泌する3-デヒドロエクジソンをエクジソンに還元し、生理活性のあるホルモンにする酵素である。これまで高い還元酵素活性が昆虫の体液中に見出され、カイコ体液から還元酵素を精製した。精製した酵素標品の絶対量がわずかだったため、マウスにより還元酵素抗体を作成した。また、精製標品をタンパク質分解酵素により部分消化し、高速液体クロマトグラフィーにより消化産物を精製後、数種の断片のアミノ酸の部分配列を決めた。これらのアミノ酸部分配列よりプライマーを作成し、PT‐PCRをおこなった。テンプレートには、幼虫の脂肪体から精製したmRNAを用い、得られたバンドを増幅後塩基配列を決めたが、部分アミノ酸配列に適合する塩基配列は得られなかった。これを数回繰り返したが、現在まで目的とする塩基配列をもつ増幅バンドは得られていない。平行して、ウェスタンブロットによる酵素タンパクの発現を種々の組織について解析するとともに、ウェスタンブロッドに用いた同じサンプル中の還元酵素活性を測定した。その結果、単位タンパク質量あたりのウェスタンブロットのバンドの濃さは、血球をのぞいたあとの体液(血清)が最も高く、次いで脂肪体、卵巣、血球が高かった。精巣からは有為な濃さのバンドがみられたが、表皮、中腸、神経系、マルピギ-管ではシグナルバンドは検出されなかった。酵素活性も、血清を除いてはこの順序で高かった。しかし、血清からのシグナルバンドの濃さは脂肪体や血球の数倍程度であったが、活性は100倍以上であった。この結果から、血清中の還元酵素はおそらく脂肪体或いは血球由来であると考えられるが、これらの組織の細胞中では不活性型になっている割合が高いものと予想される。今後、まずはmRNAの単離に集中する予定である。研究課題/領域番号:06640877, 研究期間(年度):1994出典：研究課題「昆虫体液中の3-デヒドロエクジソン還元酵素発現の解析」課題番号06640877（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-06640877/）を加工して作

エクジソン膜受容体の分子特性と機能

金沢大学大学院自然科学研究科Genomic作用に関しては、20E応答初期遺伝子の発現動態の全貌をin vivo及びin vitroで明らかにした。mEcRのクローニングは、受容体を活性を保ったまま可溶化できたが、タンパク精製、単抗体作成の両面から進めた結果、いずれも成功に至らなかった。2007年度からはカイコガゲノムデータベースから可能性のあるGPCRを網羅的に拾い出し、そのすべてに対しての発現解析をRT-PCRにより行っている。可能性のあるGPCRは100数十であり、ほぼ半数の解析を終了したが、未だに候補遺伝子を推定するには至っていない。想定される20E膜受容(mEcR)体の下流にあるシグナル伝達経路の検証を行い、以下のような、その全体を概観しうる結果を得た。mEcRはおそらくGタンパク質共役型(GPCR)であり、Gqサブユニットが共役している。次いで、phospholipase C-βの活性化、inositol 3-phosphate(IP3)の生成と続き、これがセカンドメッセンジャーとして働く。IP3は小胞体(ER)のIP3受容体に結合し、Ca^の細胞内濃度上昇を促し、protein kinase C(PKC)の活性化を介してカスパーゼ3を活性化し、核とDNAの断片化に至る。一方、核の膨潤は、この経路とは異なり、カルモジュリン-CaMKIIの経路による。ただし、CaMKIIの活性化はCa^非依存的であり、Gβγ-DG経路による可能性はあるが、その機構は不明であり、残された課題である。また、カスパーゼ3の活性化は、PKC阻害剤でもCaMKII阻害剤でも抑制されること、細胞形体の変化もCaMKII阻害剤で抑制されることから、細胞死はPKCとCaMKIIの二重支配下にあるものとされた。We clarified developmental profiles of gene expression of early response genes to 20E in the anterior silk glands during the fifth instar up to the time of cell death execution two days after gut purge. Also, we showed the gene response to 20E in vitro using anterior silk glands of gut-purged larvae. The in vivo and in vitro results indicated that a heterodimeric EcR-B1 and USP-2 may be responsible for the cell death Results also indicated involvement of E74, E75, BHR3 and BR-C isoforms, but not Ftz-F1. We are not succeeded in gene cloning of the putative membrane ecdysone receptor yet. We examined pharmacologically the signaling pathway from mEcR to cellular responses, i.e. cell condensation, nuclear condensation, DNA fragmentation and nuclear fragmentation. Ca acts as the second messenger The mEcR is suggested to be a G-protein coupled receptor (GPCR) associated with Gαq, followed by a serial activation of phospholipase c-β, generation of inositol 3-phosphate (IP_3), and release of Ca from endoplasmic reticulum probably through IP3 receptor Then, Ca activates protein kinase C (PKC) and caspase 3-like protease. This signaling pathway culminates in nuclear fragmentation and nuclear fragmentation. Nuclear condensation is regulated by a different pathway involving calmodulin and calmodulin-dependent protein kinase II (CaMK-II). However, this pathway was not activated by Ca, and therefore it is unknown whether Gαq is involved in this pathway. In addition, inhibitors of calmodulin and CaMK-II affected the occurrence of nuclear and DNA fragmentations, indicating the caspase 3-like protease activation does not depend simply on the signaling pathway of GPCR/PLC-β/IP3/Ca/PKC.研究課題/領域番号:17380035, 研究期間(年度):2005 – 2007出典：研究課題「エクジソン膜受容体の分子特性と機能」課題番号17380035（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-17380035/173800352007kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

Rectal sac distention is induced by 20-hydroxyecdysone in the pupa of Bombyx mori

Holometabolous insects do not excrete but store metabolic wastes during the pupal period. The waste is called meconium and is purged after adult emergence. Although the contents of meconium are well-studied, the developmental and physiological regulation of meconium accumulation is poorly understood. In Bombyx mori, meconium is accumulated in the rectal sac; thereby, the rectal sac distends at the late pupal stage. Here, we show that rectal sac distention occurs between 4 and 5 days after pupation. The distention is halted by brain-removal just after larval-pupal ecdysis but not by brain-removal 1 day after pupation. In the pupae, brain-removal just after ecdysis kept the hemolymph ecdysteroid titer low during early and mid-pupal stages. An injection of 20-hydroxyecdysone (20E) evoked the distention that was halted by brain-removal in a dose-dependent manner. Therefore, brain-removal caused the lack of ecdysteroid, and rectal sac distention did not appear in the brain-removed pupae because of the lack of ecdysteroid. We conclude that rectal sac distention is one of the developmental events regulated by 20E during the pupal period in B. mori. © 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved