Методика ВЭЖХ для определения полисорбата 80 в препаратах рекомбинантных терапевтических белков

Objectives. Polysorbate 80 (PS80) quantification in biopharmaceutical products has always been challenging owing to its minute content, absorption to the protein backbone, lack of specific chromophoric PS80 groups, and heterogenic nature. This work is aimed at developing an express method for PS80 analysis in biopharmaceutical products using hydrolysis and subsequent highperformance liquid chromatography analysis with ultraviolet detection that does not consume substantial amounts of sample (≥35 μL).Methods. Five therapeutic protein formulations were chosen as model proteins. Alkaline hydrolysis formulation was applied, without protein precipitation and with a range of precipitation techniques to remove protein from the test solution and hydrolyze PS80, to free fatty acids. The obtained hydrolysate was analyzed using reverse-phase high-performance liquid chromatography.Results. As a result of the high protein content of monoclonal antibody formulations, preliminary protein removal was required, which was achieved by precipitation with organic solvents. A specific precipitant ethanol–isopropanol mixture (1:1 volumetric ratio) was developed to efficiently remove antibodies while keeping PS80 in the solution. The PS80 quantification method was developed for monoclonal antibody drugs. For three monoclonal antibody drug products (adalimumab, infliximab, and eculizumab), method validation was performed according to the International Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, the United States Pharmacopeia, and the State Pharmacopeia of the Russian Federation guidelines.Conclusions. The optimal assay conditions for each group of recombinant monoclonal antibody substances were chosen. Protein precipitation with ethanol or ethanol–isopropanol mixtures before hydrolysis was introduced, allowing for a substantial reduction of sample to 35 μL or even less if PS80 content is higher than 0.05 mg/mL. Accelerated hydrolysis (90 min) is preferable to slow hydrolysis (4–18 h). Method validation for protein products such as adalimumab, infliximab, and eculizumab was demonstrated for the first time. Both methods were validated for each drug product. The coefficients of variation for method specificity and high precision were ≤6.0% for 3 analyses. The accuracy of the methods ranged from 96% to 109% for all of the tested drug products.Цели. Определение полисорбата 80 в препаратах терапевтических рекомбинантных белков всегда являлось трудной задачей, ввиду низкого содержания, гетерогенной природы, присутствия белка в препарате, а также отсутствия хромофорных групп у данного аналита. Целью данной работы являлась разработка экспрессной и экономичной методики определения полисорбата 80 в препаратах рекомбинантных моноклональных антител с использованием гидролиза с последующим определением высвобожденной олеиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ детектированием.Методы. В качестве модельных образцов выбраны пять терапевтических рекомбинантных белков. Использован щелочной гидролиз без удаления белка и с его удалением различными способами осаждения для выделения свободных жирных кислот. Полученный гидролизат проанализирован методом ВЭЖХ.Результаты. Для субстанций моноклональных антител, ввиду высокого содержания белка, требовалось его удаление. В качестве наиболее простого способа удаления выбрана денатурация и последующая преципитация белка, что достигалось путем осаждения антитела органическим растворителем. Был выбран универсальный осадитель (смесь этанола и изопропанола в объемном соотношении 1:1), использование которого позволяло эффективно удалять моноклональное антитело, но в то же время не допускать потерь полисорбата 80. Была разработана экспрессная методика определения полисорбата 80 для субстанций моноклональных антител. Методика определения полисорбата 80 валидирована согласно требованиям International Council for Harmonisation, United States Pharmacopeia и Государственной фармакопеи Российской Федерации.Выводы. Были проведены испытания условий пробоподготовки для моноклональных антител. Впервые было внедрено осаждение белка этанолом или смесью этанол-изопропанол перед проведением гидролиза и анализом полисорбата 80. Это позволило значительно уменьшить требуемое количество образца для анализа – до 35 мкл, при концентрации полисорбата 80 – 0.05 мг/мл или еще меньше при его большем содержании. Ускоренный гидролиз полисорбата 80 в течение 90 мин является более предпочтительным при проведении анализа в сравнении с продолжительным гидролизом в течение 4–18 ч, описанным в литературе. Впервые была проведена валидация методики пробоподготовки и анализа для моноклональных антител адалимумаб, экулизумаб и инфликсимаб. Высокая прецизионность методики (среднеквадратичное отклонение ≤6.0%), специфичность и удовлетворительные значения правильности (фактор отклика от 96 до 109%), говорят о пригодности методики для определения полисорбата 80 в лекарственных средствах на основе рекомбинантных моноклональных антител