Nitrate reducing bacteria and denitrifying bacteria reducing NO3¯ to N2O/N2 in tile drainage water of eutrophic lake catchment basin

Badano liczebność bakterii redukujących NO3¯ do NO2¯ i denitryfikacyjnych (redukujących NO3¯ do N2O/N2) w wodzie glebowo-gruntowej zlewni jeziora Bartąg (jezioro eutroficzne) w 6 kolejnych cyklach rocznych (w latach 1974--980). Badaniem objęto wodę ze studzienek odwierconych na wzniesieniach (studzienki 5. i 10.) oraz w zagłębieniach terenu (studzienki 2., 3., 6., 8., 13.). Średni poziom wód glebowo-gruntowych w tych studzienkach wynosił 61-75 cm p.p.t. zimą oraz 157-168 cm p.p.t. latem i jesienią. Liczba bakterii redukujących NO3¯ do NO2¯ w wodzie pobieranej z tych studzienek mieściła się w zakresie kilku rzędów wielkości. Najwięcej ich występowało w latach 1974-1976 (do 250· 106 NPL·cm-³). W latach 1977-1980 ich liczba nie przekraczała 25· 103 NPL·cm-³ . Z reguły więcej ich stwierdzano po opadach deszczu latem i jesienią. Liczba bakterii denitryfikacyjnych była większa tylko jesienią 1976 r. w wodzie pobieranej ze studzienki 3., odwierconej w zagłębieniu terenu. W latach 1975, 1978 i 1979 ich liczba nie przekraczała 14· 103 NPL·cm-³. Różnice w liczebności tych bakterii w wodzie pobieranej ze studzienek odwierconych na wzniesieniach i w zagłębieniach terenu byly różnokierunkowe. Stwierdzono istotną, dodatnią zależność korelacyjną między liczbą bakterii redukujących NO3¯ do NO2¯ w wodzie pobieranej ze studzienki 6. (w zagłębieniu terenu) a liczbą tych bakterii w wodzie pelagialu jeziora Bartąg. Wykazano ponadto dodatnią zależność korelacyjną między liczbą bakterii denitryfikacyjnych w wodzie większości studzienek (z wyjątkiem studzienki 10. na wzniesieniu) a liczbą tych bakterii w wodzie pelagialu jeziora Bartąg i w wodzie cieku powierzchniowego drenującego omawianą zlewnię.The number of nitrate reducing bacteria (NO3¯ to NO2¯) and denitrifying bacteria (reducing NO3¯ to N2O/N2) in tile drainage water of a eutrophic Bartag Lake catchment basin in 6 consecutive annual cycles (in 1974-1980) was examined. The examination comprised waters from wells drilled on tophills (wells 5 and 10) and in land depressions (wells 2, 3, 6, 8 and 13). Mean depth of tile drainage in these wells ranged from 61-75 cm in winter and 157-168 cm in summer and autumn. The number of NO3¯ to NO2¯ reducing bacteria in water samples from these wells varied significantly. The highest number up to 250· 106 MPN·cm-³ was observed in 1974-1976. In 1977-1980 their number did not exceed 25,000 MPN·cm-³. In an annual cycle their higher numbers were observed after rainfalls in summer and autumn. The number of denitrifying bacteria reached the highest values only in autumn 1976 in water sampled from well 3 drilled in a land depression. In 1975, 1978 and 1979 their number did not exceed 14,000 MPN·cm-³. The differences in their amounts in water taken from the wells drilled on tophills and in land depressions were ambiguous. Significant positive correlation was found between the number of NO3¯ to NO2¯ reducing bacteria taken from the well 6 (in a land depression) and the number of these bacteria in water of Bartag Lake. Moreover, a significant relationship was noted between the number of denitrifying bacteria in water from most wells (except the well 10 situated on the hills) and the number of these bacteria in the water of Bartąg Lake and in the water of a stream draining the catchment

Spatial distribution and seasonal changes of the number of nitrogen-fixing (free living) and oligonitrophilic bacteria in tile drainage water of eutropic lake catchment basin

Badano liczebność bakterii wiążących azot atmosferyczny w warunkach tlenowych (Azotobacter sp. i in.) i beztlenowych (Clostridium pasteurianum) oraz bakterii oligonitrofilnych w wodzie glebowo-gruntowej zlewni eutroficznego jeziora Bartąg w rejonie Olsztyna. Badania przeprowadzono w latach 1974-1980 w wodzie pobieranej ze studzienek odwierconych w zagłębieniach terenu i na wierzchowinach. Studzienki były rozmieszczone na różnie użytkowanych glebach (orne, łąkowe), z różnym poziomem wód glebowo-gruntowych. W wodzie tych studzienek przeważały bakterie tlenowe i oligonitrofilne. Liczba bakterii wiążących azot atmosferyczny w warunkach beztlenowych była co najmniej 10-krotnie mniejsza. Bakterie wiążące azot atmosferyczny w warunkach tlenowych i bakterie oligonitrofilne występowały z reguły w większych ilościach w wodzie glebowo-gruntowej pobieranej ze studzienek na wierzchowinach, a bakterie wiążące azot atmosferyczny w warunkach beztlenowych - w wodzie ze studzienek w zagłębieniach terenu. Więcej tych drobnoustrojów występowało nierzadko po opadach deszczu o charakterze burzowym. Wyniki obliczeń statystycznych wykazały wysoce istotną (p < 0,0l) dodatnią współzależność jedynie między liczbą bakterii wiążących azot atmosferyczny w warunkach tlenowych i bakterii oligonitrofilnych w wodzie glebowo-gruntowej zlewni jeziora Bartąg a ich liczebnością w wodzie pelagialu tego zbiornika W przypadku bakterii oligonitrofilnych współzależność taką stwierdzono również w wodzie cieku powierzchniowego drenującego tę zlewnię.The number of aerobic nitrogen-fixing bacteria (Azotobacter sp. and others) and anaerobic nitrogen-fixing bacteria (Clostridium pasteurianum) and oligonitrophilic bacteria in tile drainage water of a eutrophic Lake Bartąg catchment basin situated near Olsztyn was examined. The studies were carried out in 6 consecutive annual cycles (in 1974-1980) on water collected from piezometric wells situated in a land depression and on a hilltop. Besides, wells were differentiated by their localization in arable soils, meadow soils and by the level of tile drainage depth. Aerobic bacteria (Azotobacter sp. and others) and oligonitrophilic bacteria predominated in tile drainage water of an agricultural catchment of Bartąg Lake. The number of anaerobic nitrogen-fixing bacteria (Clostridium pasteurianum) was at least 10 times lower. Aerobic nitrogen-fixing bacteria and oligonitrophilic bacteria were more numerous in tile drainage water collected from wells on hilltops, whereas anaerobic nitrogen-fixing bacteria were generally more numerous in waters from land depressions. More such microorganisms were sometimes found after rainstorms. Statistical calculations showed significant (p < 0.01) positive correlation only between the number of aerobic nitrogen-fixing bacteria (Azotobacter sp. and others) and oligonitrophilic bacteria in tile drainage water of Bartąg Lake catchment basin and their numbers in pelagic water of this reservoir. In the case of oligonitrophilic bacteria the relationship was also significant for water of a stream flowing to the lake

Badania mikrobiologiczne gleb lakowych nawadnianych biologicznie oczyszczonymi sciekami

Badano liczebność bakterii heterotroficznych, bakterii przetrwalnikujących tlenowych, promieniowców oraz grzybów nitkowatych i drożdżoidalnych w glebach łąkowych nienawadnianych i nienawożonych (kontrolnych), w glebach nawadnianych odpływami z mechaniczno-biologicznej oczyszczalni oraz w glebach nawadnianych tymi samymi odpływami retencjonowanymi w stawie biologicznym oraz nawadnianych czystą wodą bez lub z nawożeniem mineralnym NPK. Nie stwierdzono większych różnic w liczebności badanych grup drobnoustrojów w glebach 8 różnych wariantów nawodnieniowo-nawożeniowych. W glebach nienawadnianych i nienawożonych (kontrolnych) oraz w glebach nawadnianych odpływami ściekowymi retencjonowanymi w stawie biologicznym maksymalne liczebności badanych grup drobnoustrojów występowały w warstwie z głębokości 0-10 cm. W głębszych warstwach gleby (15-25 cm i 30-50 cm) ich liczba się zmniejszała. W powierzchniowej warstwie gleby (z głębokości 0-10 cm) maksymalne liczebności bakterii heterotroficznych stwierdzano w październiku 1997 r., promieniowce i grzyby w lipcu 1996 i/lub 1997 r.Numbers of heterotrophic bacteria, aerobic spore-forming bacteria, actinomycetes and fungi (filamentous and yeasts) were studied in meadow soils non irrigated; irrigated with: sewage effluent; sewage effluent after retention in biological pond at three various volumes; pure water with or without mineral fertilizers and fertilized only with mineral NPK. The studies were carried out in 1996 and 1997. No big differences in the numbers of investigated microorganism groups in soil of all 8 experimental variants were stated. Maximal numbers of all microorganism groups in 0-10 cm layer of soil not irrigated and not fertilized (control) as well as in the soil irrigated with sewage effluent after retention in biological pond. In deeper soil layers (15-25 cm and 30-50 cm) their numbers generally decreased. Numbers of all microorganism groups varied within the investigation period

Spatial distribution and seasonal changes in the number of actinomycetes, filamentous fungi and yeasts in water of an eutropic lake and its catchment basin

Badano przestrzenne rozmieszczenie i sezonowe zmiany liczebności promieniowców, grzybów nitkowatych i grzybów drożdżoidalnych w wodzie gruntowej zlewni jeziora Bartąg (jezioro eutroficzne) ze studzienek odwierconych w zagłębieniach terenu (studzienki 2., 3., 6., 8., 13.) i na wzniesieniach (studzienki 5. i 10.), w wodzie pelagialu tego zbiornika, pobieranej z głębokości 0,3, 6,0 m i znad dna (na stanowiskach I i II północnym i południowym) oraz w wodzie cieków powierzchniowych drenujących jego zlewnię (dopływającego i odpływającego z jeziora). W większości próbek wody gruntowej pobieranej na terenie zlewni (woda gruntowa) jedynie grzyby drożdżoidalne występowały liczniej. Na ogół więcej ich występowało w próbkach ze studzienek odwiercanych w zagłębieniach terenu. Natomiast w wodzie pelagialu jeziora Bartąg brak było większych różnic w liczebności tych drobnoustrojów na stanowiskach I i II. Z reguły mniej ich występowało w wodzie odpływającej z jeziora, więcej w wodzie dopływającej. W cyklu rocznym minimalna liczebność tych drobnoustrojów była notowana najczęściej wiosną (w kwietniu i maju), maksymalna zaś jesienią (w okresie od października do grudnia), niekiedy również latem po opadach burzowych.Spatial distribution and seasonal changes in the number of actinomycetes, filamentous fungi and yeasts were studied in ground water of the Lake Bartąg catchment, in pelagial zone of the lake and in streams flowing to and from Lake Bartąg. The study was carried out in two annual cycles (in 1978 and 1980). Water samples were collected from 2 wells situated on hilltop (wells 5 and 10), from 5 wells drilled in land depressions (wells 2, 3, 6, 8 and 13), from 2 sites (site I and II) of pelagial zone of Lake Bartąg (from a depth of 0.3 m, 6.0 m, and above the bottom) and from inflowing and out-flowing streams. Low densities of actinomycetes and filamentous fungi, not exceeding 36 and 97 cfu·cm-3 respectively, were found in water. From among all studied groups of microorganisms, yeasts were the most numerous in water samples collected from different sites and reached a maximum of 1 710 cfu·cm-3. In ground water of Lake Bartąg catchment basin they were more numerous in water samples from wells drilled in land depressions. There were no differences between the number of yeasts in water samples collected from pelagial of northern and southern part of Lake Bartąg. Higher numbers of these microorganisms, as a rule, were found in water flowing to the lake than in water of the outflowing stream. In annual cycle, lower number of yeasts was found in spring (April and May), while they were most numerous in autumn month (November and December) and sometimes in summer after storm rainfalls

Drobnoustroje czynne w obiegu azotu w glebach lakowych nawadnianych odplywami z mechaniczno-biologicznej oczyszczalni sciekow

Badano wpływ nawadniania odpływami z mechaniczno-biologicznej oczyszczalni ścieków lub nawożenia mineralnego NPK gleb łąkowych na liczebność bakterii proteolitycznych, amonifikacyjnych, nitryfikacyjnych I i II fazy, redukujących NO₃⁻ do NO₂⁻ oraz wiążących azot atmosferyczny w warunkach tlenowych (Azo-tobacter i in.) i beztlenowych (Clostridium pasteurianum). Badania przeprowadzono w 8 różnych wariantach nawodnieniowo-nawożeniowych na poletkach łąkowych przy oczyszczalni ścieków w Olsztynku. Stwierdzono częstokroć większe liczebności badanych bakterii cyklu azotowego w glebach nawadnianych odpływami ściekowymiz oczyszczalni lub tymi samymi odpływami retencjonowanymi w stawie biologicznym aniżeli w glebach nienawadnianych (kontrolnych). Niekiedy większe liczebności tych bakterii występowały przy wyższych dawkach nawodnieniowych ścieków odpływających z oczyszczalni i dodatkowo retencjonowanych w stawie biologicznym. W glebach nawożonych NPK liczby badanych bakterii były porównywalne ze stwierdzanymi w glebach nawadnianych odpływami z mechaniczno-biologicznej oczyszczalni ścieków. W glebach nienawadnianych i nienawożonych liczby badanych bakterii cyklu azotowego były z reguły większe w warstwie z głębokości 0 - 10 cm, mniejsze w warstwach z głębokości 15 - 25 cm i 30 - 50 cm; w glebach nawadnianych odpływami z oczyszczalni retencjonowanymi w stawie biologicznym niekiedy więcej ich stwierdzano w warstwach z głębokości 15 - 25 cm i/lub 30 - 50 cm. Dotyczyło to zwłaszcza bakterii redukujących NO₃⁻ do NO₂⁻ i bakterii wiążących azot atmosferyczny.The studies were undertaken to determine the amounts of proteolytic, ammonifying, nitrifying (ammonia-oxidizing and nitrite-oxidizing), nitrate-reducing, denitrifying and nitrogen-fixing (Azotobacter and Clostridium) bacteria in meadow soils irrigated with the sewage from a mechanical-biological sewage treatment plant, and fertilized with NPK. The research was carried out in 1996 - 1997, in 8 variants, near a sewage treatment plant in Olsztynek. The amounts of the nitrogen-cycle bacteria examined were much higher in soils irrigated with biologically treated sewage or with the same sewage after retention in a biological pond, as compared with non-irrigated and non-fertilized (control) soils. Sometimes a larger number of those bacteria was noted in case of higher doses of sewage after retention in a biological pond. The bacterial amounts in soils fertilized with NPK were similar to that observed in soils irrigated with sewage from a mechanical-biological treatment plant. In non-irrigated and non-fertilized soils, the number of nitrogen-cycle bacteria was usually higher in top layer (0 - 10 cm), and lower in the layers of 15 - 25 cm and 30 - 50 cm. In meadow soils irrigated with the sewage from mechanical-biological treatment plant after retention in biological pond, their amounts were sometimes higher in the layers of 15 - 25 cm and 30 - 50 cm. This concerned, first of all, the nitrate-reducing and nitrogen-fixing bacteria

Vertical changes in the numbers of selected groups of nitrogen cycle bacteria and their significance in the nitrogen flux in waters of Lake Hańcza

W pracy przedstawiono wyniki badań pionowego rozmieszczenia liczebności bakterii amonifikacyjnych, nitryfikacyjnych utleniających NH4+ do NO2- i NO2- do NO3-, redukujących NO3- do NO2- i denitryfikacyjnych (redukujących NO3- do N2O lub N2) oraz warunków termiczno-tlenowych występujących w wodzie najgłębszego w Polsce jeziora Hańcza (108,5 m gł.). Badania prowadzono w latach 1997-1999. Wodę do badań pobierano w odstępach miesięcznych od kwietnia do października na trzech stanowiskach usytuowanych w najbardziej charakterystycznych, najgłębszych miejscach jeziora. Stwierdzono różnice w rozmieszczeniu przestrzennym i sezonowym oznaczanych grup drobnoustrojów w zależności od miejsca, głębokości i daty poboru prób. Najmniej licznie występowały bakterie nitryfikacyjne utleniające NH4+ do NO2- i NO2- do NO3- oraz denitryfikacyjne (często nie stwierdzano ich w badanych próbkach wody), najliczniej natomiast bakterie amonifikacyjne i redukujące NO3- do NO2-. Pionowe rozmieszczenie liczebności bakterii biorących udział w mineralizacji związków azotu w toni wodnej było różne, zależne od daty poboru prób wody. Maksymalną ich liczebność stwierdzano przeważnie w wodzie na głębokości od 0,0 do 5 m, na głębokości 10 lub 50 m, czasami przy dnie. Jedynie liczba bakterii nitryfikacyjnych utleniających NH4+ do NO2- i NO2- do NO3- oraz denitryfikacyjnych (redukujących NO3- do N2O lub N2) bywała bardziej wyrównana w toni wodnej. Stwierdzone istotne (ujemne lub dodatnie) współzależności między liczbą bakterii (amonifikacyjnych, nitryfikacyjnych, denitryfikacyjnych) mineralizujących organiczne związki azotu a niektórymi parametrami fizykochemicznymi wody jeziora Hańcza sugerują, iż bakterie te mogą stanowić wskaźnik intensywności procesów mineralizacji substancji organicznej, a tym samym jakości wody, co może być pomocne w opracowaniu metod ochrony badanego jeziora i innych jezior o różnej typologii.Studies were carried out in the period 1997-1999 to determine the vertical distribution of the numbers of ammonifying bacteria, nitrifying bacteria oxidizing NH4+ to NO2- and NO2- to NO3-, bacteria reducing NO3- to NO2- as well as denitrifying bacteria (reducing NO3- to N2O or N2) in waters of the Polish deepest Lake Hańcza (depth: 108.5 m). Moreover, the temperature and oxygen conditions were studied in the lake. Water samples were collected at monthly intervals from April to October from three sites situated in the most characteristic and deepest points of the lake. Differences in spatial and seasonal distribution of the examined microorganisms were found to depend on the site, depth and sampling time. The nitrifying bacteria oxidizing NH4+ to NO2- and NO2- to NO3- and denitrifying bacteria (they were frequently absent in the water samples) occurred in the smallest numbers, whereas ammonifying bacteria and bacteria reducing NO3- to NO2- were present in large numbers. Vertical distribution of the numbers of bacteria mineralizing nitrogen compounds varied with depth and depended on sampling time. Their maximum numbers were usually recorded at depths from 0.0 to 5 m, at 10 m or 50 m and sometimes at the bottom of the lake. The number of nitrifying bacteria oxidizing NH4+ to NO2- and NO2- to NO3- and denitrifying bacteria (reducing NO3- to N2O or N2) was more uniform in the water column. Significant correlations (negative or positive) between the numbers of bacteria (ammonifying, nitrifying, denitrifying) mineralizing nitrogen organic compounds and some physico-chemical parameters of Lake Hańcza waters suggest that these bacteria may be used as an indicator of the intensity of organic matter mineralization and thus may indicate water quality. This, in turn, could be a helpful tool in developing methods to protect the studied lake or other lakes of various types

Filamentous and yeast-like fungi in water and bottom sediments of the Czarna Hańcza river as bioindicators of pollution

Przeprowadzono badania liczebności grzybów nitkowatych i drożdżoidalnych w wodzie i osadach dennych Czarnej Hańczy na odcinku od miejscowości Stary Bród (przed Suwałkami) do miejscowości Wysoki Most, na krańcach Wigierskiego Parku Narodowego. Określano również ich liczbę w ściekach oczyszczonych, odpływających z oczyszczalni w Suwałkach. Na podstawie liczebności tych drobnoustrojów (zwłaszcza grzybów drożdżoidalnych) w wodzie wyróżniono dwa odcinki rzeki - jeden do jej ujścia do jeziora Wigry (suwalski) i drugi - od jej ujścia z tego jeziora (wigierski). Pierwszy odcinek rzeki charakteryzował się dużą liczebnością badanych drobnoustrojów, zwłaszcza grzybów drożdżoidalnych, w ciągu całego okresu badawczego (od czerwca do listopada), z maksimum w miesiącach czerwiec i sierpień oraz mniejszym pikiem w listopadzie. Na drugim występowała średnio 2-krotnie mniejsza liczebność grzybów nitkowatych i kilkakrotnie mniejsza liczebność grzybów drożdżoidalnych w wodzie. Piaszczyste osady denne Czarnej Hańczy charakteryzowały się mniejszą liczebnością badanych drobnoustrojów niż osady muliste. Na przestrzenne rozmieszczenie grzybów nitkowatych i drożdżoidalnych mogą mieć wpływ wprowadzane do rzeki oczyszczone ścieki z oczyszczalni w Suwałkach i zanieczyszczenia ze zlewni podczas opadów burzowych oraz rozcieńczenie mas wodnych przez jeziora Wigry i Postaw. Udział grzybów barwnych w ogólnej liczbie tych drobnoustrojów, zmienny w zależności od czasu i miejsca poboru prób, był mniejszy w osadach dennych, większy zaś w wodzie Czarnej Hańczy.The density of filamentous and yeast-like fungi (including pigmented ones) in water and bottom sediments of the Czarna Hańcza River was studied along the length of the river from Stary Bród (before Suwałki) to Wysoki Most at the border of the Wigry National Park. Parallel to this study, the density of these microorganisms (and yeast-like fungi in particular) was determined in treated wastewater discharged from a wastewater treatment plant in Suwałki. Two sections of the river were distinguished according to the counts of fungi in the river water: the first from springs to the river outlet to Lake Wigry (the Suwałki section) and the second from its outflow from Lake Wigry (the Wigry section). The former section of the river was characterized by high densities of the analyzed microorganisms, particularly of yeast-like fungi, throughout the whole study period (from June to November), with the maximum counts noted in June and August and a smaller peak in November. The latter section of the river contained on average two-fold less filamentous fungi and several-fold lower numbers of yeast-like fungi in water. Sandy bottom deposits of the Czarna Hańcza contained less of the analyzed microorganisms than the muddy ones. The spatial distribution of filamentous and yeast-like fungi could be affected by treated wastewaters from the wastewater treatment plant in Suwałki, by the influx of polluted rainwater during storm events and by the diluting effect of water masses from Lake Wigry and Lake Postaw. Contribution of pigmented fungi to the total number of fungi, variable depending on the time and sampling site, was smaller in the river bottom sediments than in water of the Czarna Hańcza

Seasonal changes in the numbers of actinomycetes, filamentous fungi and yestes in water, soil and plants of wetlands near Olsztyn

Badano sezonowe zmiany liczebności promieniowców i grzybów nitkowatych i drożdżoidalnych w wodzie, glebie oraz na zanurzonych w wodzie i wynurzonych z niej (napowietrznych) częściach turzycy błotnej (Carex acutiformis Ehrb.), a także jej korzeniach (obumarłych i żywych). Badania przeprowadzono na jednym z większych obszarów bagiennych okolic Olsztyna (Pojezierze Mazurskie) w latach 1993 i 1994. We wszystkich badanych biotopach najmniej było promieniowców, więcej (10-krotnie) grzybów nitkowatych, najwięcej (100-krotnie) grzybów drożdżoidalnych niewytwarzających barwników karotenoidowych. Grzyby drożdżoidalne z rodzaju Rhodotorula, Sporobolomyces występowały rzadko i zwykle tylko w 1993 r. Na wynurzonych z wody częściach turzycy błotnej (Carex acutiformis Ehrb.) nie stwierdzono ich obecności. Różnice liczebności badanych grup systematycznych drobnoustrojów w odpowiednich biotopach z poszczególnych stanowisk były najczęściej niewielkie. Maksymalne wartości ich liczebności występowały częściej wiosną i/lub latem, rzadziej jesienią, a wyjątkowo zimą (w grudniu 1993 r. i w marcu 1994 r.).The paper presents result of a study on the seasonal distribution of actinomycetes, filamentous fungi and yeasts in water, soil and on surface of immersed and aerial leaves of the sedge (Carex acutiformis Ehrb.) and on dead and live roots. The study was carried out in one of the largest wetlands near Olsztyn (in Masurian Lakeland) in 1993 and 1994. In all samples of water, soil and particular parts of sedge, actinomycetes were the least frequent, filamentous fungi occurred in 10-fold greater numbers whereas yeasts occurred in 100-fold greater numbers. "Pink yeasts" were rare and occurred usually only in 1993. They were absent on aerial leaves of sedges. The differences in the numbers of studied taxonomic groups of these microorganisms between particular sites in water, soil and sedge were small. Seasonal changes in their numbers were characterised by maximum values found most often in spring and/or in summer, rarely in autumn, and only exceptionally in winter (in December 1993 and in March 1994)