A szekurin-szeparáz rendszer szerkezeti-funkcionális jellemzése = Structural and functional characterisation of the securin-separase system

A munkaterv azt a célt tűzte ki, hogy a sejtciklusban fontos szerepet játszó szeparáz enzim és rendezetlen inhibítora (szekurin) részletes szerkezeti elemzésén keresztül közelebb jutunk a rendezetlen fehérjék funkciójának jobb megértéséhez. Ezen tervek nagyrészt megvalósultak, elsősorban a humán szekurin klónozását, és részletes szerkezeti jellemzését sikerült megoldanunk, ezen eredményeket két cikkben publikáltuk. Elkészültünk többféle szekurin (S. cerevisiae, D. melanogaster és humán) összehasonlító szerkezeti vizsgálatával is, ezen eredmények publikációja folyamatban van. A szeparáz enzim katalitikus doménjének klónozása sikerült, nagyszámú konstrukció készült és több is jól kifejeződő fehérjét eredményezett, amelyek aktivitását azonban nem tudtuk mérni. A munkát folytatjuk, folyamatban van egyrészt a fehérje különböző körülmények közötti kifejezése, denaturációja és renaturációja, és aktív formában való előállítása, másrészt nemzetközi együttműködésben Prof. Darren Hart-tal (EMBL Grenoble) az ESPRIT (Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncation) könyvtár-szűrési technika alkalmazása oldható és aktivitást mutató szeparáz konstrukció létrehozására. A fehérjék szerkezeti rendezetlenségének vizsgálata eközben számos más területeken is hatékonyan folyt, az OTKA K60694 pályázat támogatásának összesen 19 publikáció jelent meg. | The main goal of the proposed work was the detailed structure-function characterization of separase, a key enzyme in cell-cycle regulation and its intrinsically disordered inhibitor, securin. We planned to clone and isolate the two proteins, characterize their structure and interaction with particular focus on the disordered structural state of securin. We achieved part of this goal, mostly the cloning, expression and structural characterization by NMR of human securin, which was published in two papers. We also completed the comparative structural study of three different securins (S. cerevisiae, D. melanogaster and human), which is under publication. We managed to clone and express several constructs of the catalytic domain of separase, which resulted in soluble forms of the protein, without enzymatic activity, though. We continue this research by varying expression conditions, including denaturation-renaturation cycles to produce active separase, and also by an international collaboration with Prof. Darren Hart-tal (EMBL Grenoble) with the application of the ESPRIT (Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncation) technique in order to generate enzymatically active separase. Besides studies on the securin-separase system, we have carried out many other lines of productive research on intrinsically disordered proteins with the help of OTKA K60694 grant: we published 19 papers with acknowledging the grant

Rendezetlen fehérjék: a szerkezet-funkció paradigma kiterjesztése = Intrinsically disordered proteins: extension of the structure-function paradigm

Kísérletes eredmények: Rendezetlen chaperonok hatása, a riboszomális fehérjék kettős chaperone hatásának kimutatása. A rendezetlen fehérjék ellenállnak a hideg-denaturációnak. A rendezetlen fehérjéknek egyedi a hidratációja. Rendezetlenség kimutatása liofilizált mintákból. A rendezetlenség korrelál a kromoszómális transzlokációval. Az állványfehérjéknek magas a rendezetlensége. Új NMR technika a rendezetlen fehérjék elemzésére. Az ERD14 NMR jelhozzárendelése és szerkezeti-dinamikai jellemzése. Az androgén receptor rendezetlen régiójának hossza kapcsolatban van a kognitív képességekkel. A rendezetlen fehérjék crowding körülmények között sem tekerednek fel. Elméleti megfigyelések: Kötött állapotban megfigyelhető rendezetlenség (bolyhsosság) elemzése, a domén koncepció kiterjesztése a rendezetlenségre, az amiloidokban mutatkozó rendezetlenség leírása. Bioinformatikai eredmények: A hipertermofil baktériumokban a rendezetlenség aránya alacsony. Az alternatív splicing során kialakuló kettős kódolású szakaszokról átíródó fehérjék rendezetlensége teszi lehetővé az alternatív fehérjék létét. A rendezetlenség közvetlen kapcsolatban van a fehérje funkciójával, így harmadlagos szerkezeti elemnek tekinthető. Predikciós módszer kidolgozása az alternatív splicing során létrejövő fehérje életképességének megállapítására. A poty-vírus VPg sokféle funkcióban vesz részt, köszönhetően szerkezeti flexibilitásának. Egyéb eredmények: Review a rendezetlenség kutatásának új szakaszáról. | Experimental results: Study of the disordered chaperones, the determination of the double chaperone effect of ribosomal proteins, resistance of the IDPs to cold denaturation. Determination of the unique hydration of IDPs. Determination of protein disorder from lyophilized samples. Protein disorder correlates with chromosomal translocation. Scaffold proteins contain a high level of structural disorder. Designing a new NMR method for the study of IDPs. Assignation of NMR signals of ERD14 and its structural-dynamics characterization. The observation that the length of the disordered region of androgen receptor is related to cognitive capabilities. IDPs remain unfolded even under crowding conditions. Theoretical observations: Analysis of disorder in the bound form (fuzziness), extending the domain concept to IDPs, description for disorder in amyloids. Bioniformatical results: Observation of low levels of disorder in hyperthermophil bacteria. Alternative protein forms are able to evolve because of the disordered nature of the transcripts of dual coding sequences, that result from alternative splicing. Disorder is in intimate connection to function, thus it should come under the category of tertiary structural elements. Designing a prediction method to determine the viability of a protein from an alternative splice event. The VPg protein of poty virus possesses many different functions, thanks to its structural flexibility. Other results: Review of the new era of disorder research