Ruolo del gene flhF nella motilità e nella secrezione proteica in Bacillus cereus

Bacillus cereus è un bastoncello Gram positivo, sporigeno e mobile grazie alla presenza di flagelli peritrichi. Da lungo tempo noto come contaminante degli alimenti e patogeno alimentare, Bacillus cereus viene sempre più frequentemente riconosciuto anche come agente responsabile di infezioni locali e sistemiche nell’uomo. Il potenziale patogenetico del microrganismo è dovuto alla secrezione di una varietà di enzimi e fattori di virulenza, che comprendono emolisine, fosfolipasi, proteasi, citotossine e complessi enterotossici, ma anche a fattori di motilità flagello-dipendenti (swimming e swarming) che possono favorire l’adesione e la diffusione nei tessuti dell’ospite. In particolare, la motilità swarming, migrazione collettiva delle cellule su una superficie solida che prevede la differenziazione di cellule planctoniche in cellule swarm, è stata associata ad un aumento della virulenza di B. cereus in modelli animali. In uno studio precedente effettuato dal laboratorio in cui è stato svolto il presente lavoro di tesi, è stato dimostrato che la proteina FlhF di B. cereus è necessaria per la corretta produzione di flagelli e per la secrezione di alcuni fattori virulenza. Il gene flhF, identificato anche in altri microrganismi flagellati, codifica per una proteina citoplasmatica che mostra omologia strutturale con la famiglia delle signal recognition particle (SRP), responsabili del trasporto alla membrana plasmatica di proteine che debbono essere esportate all’esterno della cellula o essere collocate all’interno della membrana stessa. Un mutante di B. cereus (ΔflhF o MP06) portante una delezione in flhF mostrava un alterato profilo di secrezione di alcune tossine batteriche ed, in particolare, una riduzione della componente L2 dell’emolisina BL (HBL-L2) e della citotossina K (CytK), ma anche un’alterazione del numero e della localizzazione dei flagelli sulla superficie cellulare ed una riduzione nella quantità di flagellina extracellulare. Il presente lavoro di tesi si è posto l’obiettivo di comprendere se FlhF potesse svolgere il ruolo di SRP in B. cereus e se tale proteina potesse essere coinvolta in funzioni cellulari dipendenti dal targeting di proteine alla membrana, tra cui motilità swimming, differenziamento swarming e secrezione di fattori di virulenza. In una prima parte del lavoro, è stato valutato l’effetto della deplezione di FlhF portata dal ceppo ΔflhF sulla motilità swimming in terreno semisolido e sul differenziamento e la migrazione swarming su una superficie solida di crescita. I risultati hanno evidenziato che il ceppo ΔflhF presenta una marcata riduzione della motilità swimming ed una completa incapacità sia di migrare su superfici solide che di produrre cellule swarm differenziate. Per comprendere meglio i meccanismi molecolari con cui FlhF può regolare, direttamente o indirettamente, la produzione di flagelli e la secrezione di fattori di virulenza, sono stati effettuati esperimenti d’interazione proteina-proteina mediante l’impiego del Bacterial Two Hybrid System (BACTH). A questo scopo, sono stati allestiti numerosi costrutti portanti i geni flhf, hblC (codificante la componente L2 dell’emolisina BL), cytK (codificante la citotossina K) e flaC (codificante la flagellina) fusi in frame con in frammenti T18 e T25 di un sistema reporter basato sull’attività dell’adenilato ciclasi. Gli esperimenti di spot assay effettuati per valutare l’interazione fisica diretta tra FlhF e le suddette proteine e, quindi, avvalorare il ruolo di FlhF come SRP hanno dimostrato che questa interagisce fisicamente con CytK e HBL-L2 mentre, secondo questo modello teorico FlhF non sembra interagire con la flagellina BC1657. Per verificare che il difetto di secrezione dei fattori di virulenza CytK e HBL-L2 e della flagellina BC1657, da parte del ceppo ΔflhF, non fosse dovuto ad una concomitante riduzione dei livelli di espressione dei geni codificanti queste proteine, è stato effettuato un confronto dei livelli di espressione dei geni stessi, tra il ceppo parentale e il ceppo mutante, mediante studi di Real Time PCR quantitativa. Dai risultati è emerso come la mancanza di FlhF nel ceppo MP06 comportasse una riduzione dei livelli di espressione di bc1657 e di cytK, mentre non influiva in alcun modo sull’espressione di hblC. Considerando i dati ottenuti dal saggio di interazione e dagli studi di Real Time PCR, si può affermare che la riduzione dei livelli di espressione della proteina BC1657 nel secretoma del ceppo MP06, può essere giustificata completamente dalla riduzione dei livelli di espressione del gene bc1657 nello stesso ceppo. Questa è probabilmente dovuta ad un effetto di feedback negativo sull’espressione della flagellina causato dal ridotto numero di flagelli assemblati sulla superficie del ceppo mutante ΔflhF. La diminuita secrezione di CytK sembra essere dovuta alla duplice azione di FlhF, sia nella regolazione dei suoi livelli di espressione, che nel suo trasporto verso i sistemi di secrezione, in particolare verso il Sec traslocase, per cui CytK possiede il peptide segnale. Infine la proteina HBL-L2, mostra dei livelli di espressione nel mutante ΔflhF, comparabili a quelli nel ceppo parentale e una interazione fisica con FlhF secondo il modello in vivo utilizzato. Si può ipotizzare che la riduzione della secrezione della componente L2 possa essere imputata alla deplezione di FlhF e alla sua mancata azione come proteina SRP-like, indirizzando L2 verso i sistemi di secrezione, tra cui probabilmente il sistema di secrezione flagellare. In conclusione, nella presente tesi è stato valutato che FlhF ha un ruolo nella capacità di Bacillus cereus di muoversi, sia in ambiente liquido sia sulle superfici solide, inoltre sembra essere implicata nel trasporto dei fattori di virulenza CytK e HBL-L2 verso i sistemi di secrezione specifici

Screening High Content nella ricerca di nuovi composti antivirali

La pandemia COVID-19 ha causato ad oggi più di 200 milioni di casi e più di 4,5 milioni di morti sulla popolazione globale, ed è causata dall’agente infettivo SARS-CoV-2 un β-coronavirus. Questo nuovo coronavirus è un patogeno zoonotico, probabilmente originatosi dai pipistrelli e trasmesso all’uomo tramite un ospite intermedio. SARS-CoV-2 fa parte dei coronavirus altamente patogeni che causano patologie respiratorie gravi, in cui il danno polmonare è mediato sia dalla replicazione virale che dalla risposta infiammatoria e immunitaria che sono gravemente compromesse. Il meccanismo di ingresso di SARS-CoV-2 avviene prevalentemente per endocitosi, attraverso il legame tra l’anti-recettore virale Spike ed il recettore cellulare ACE2, La campagna vaccinale in corso, basata prevalentemente sulla somministrazione di BNT162b2 (Pfizer) e mRNA-1273 (Moderna) ha dimostrato di prevenire efficacemente il COVID-19. Tuttavia, l’emergenza di nuove varianti e lo scarso accesso ai vaccini nei paesi in via di sviluppo, rendono necessaria la ricerca di nuovi composti antivirali contro SARS CoV-2. Al momento la terapia farmacologica contro l’infezione mira a controllare i sintomi e l’eccessiva attivazione del sistema immunitario nei pazienti. Nel presente lavoro abbiamo contribuito a caratterizzare l’azione antivirale di un composto dalle spiccate attività antinfiammatorie e anti-nocicettive, la Palmitoiletanolamide. La Palmitoiletanolamide è ad oggi è stata proposta in letteratura per il trattamento del danno polmonare acuto e in patologie neurologiche infiammatorie causati dal COVID-19. Da analisi preliminari di docking molecolare è emerso che la Palmitoiletanolamide si lega ad ACE2 e alla Spike, in particolare nel sito di interfaccia tra le due molecole. Questo legame può potenzialmente avere un effetto di riduzione dell’infettività di SARS-CoV-2, quindi abbiamo deciso di testare l’efficacia della Palmitoiletanolamide in un modello cellulare in vitro. I nostri risultati hanno dimostrato che basse concentrazioni di Palmitoiletanolamide siano efficaci nel ridurre la replicazione virale di SARS-CoV-2, sia per il ceppo wild type che per la variante Delta. Inoltre, tramite l’utilizzo del sistema Operetta® High Content Imaging è stato possibile quantificare la differenza nel numero di cellule infettate da SARS-CoV-2 a seguito del trattamento con la Palmitoiletanolamide. Dato il ruolo di questa molecola nella regolazione del metabolismo lipidico operata tramite l’attivazione del recettore nucleare PPAR-α, e in particolare nell’attivazione della lipolisi, abbiamo voluto quantificare se la somministrazione esogena di Palmitoiletanolamide avesse tale effetto in vitro. Tramite microscopia confocale abbiamo visualizzato il numero di vescicole lipidiche contenute nel citoplasma di cellule non trattate e trattate con la Palmitoiletanolamide, osservando una riduzione significativa di queste. Questo dato è rilevante in quanto SARS-CoV-2 come altri virus a RNA, localizza la replicazione all’interno di tali vescicole. Abbiamo voluto poi misurate quanto l’effetto di riduzione del numero di cellule infette causato dalla Palmitoiletanolamide fosse riconducibile al suo legame con ACE2 o Spike e quindi all’inibizione dell’entrata di SARS-CoV-2. Tali esperimenti sono stati fatti utilizzando un vettore lentivirale pseudotipizzato esprimente la proteina Spike, utilizzato per trasdurre cellule suscettibili, in presenza o in assenza di Palmitoiletanolamide. Queste condizioni sperimentali hanno ricondotto ad una riduzione del numero di cellule trasdotte, concordante con i risultati ottenuti precedentemente. Possiamo quindi concludere che la Palmitoiletanolamide è una molecola da tenere in considerazione per il trattamento di SARS-CoV-2, per il suo duplice ruolo di antivirale e di modulatore del sistema immune e infiammatorio. Studi successivi saranno necessari per comprendere meglio il meccanismo di azione di questa molecola e ottimizzare un sistema di somministrazione applicabile in vivo

GTP-Dependent FlhF Homodimer Supports Secretion of a Hemolysin in Bacillus cereus

The multidomain (B-NG) protein FlhF, a flagellar biogenesis regulator in several bacteria, is the third paralog of the signal recognition particle (SRP)-GTPases Ffh and FtsY, which are known to drive protein-delivery to the plasma membrane. Previously, we showed that FlhF is required for Bacillus cereus pathogenicity in an insect model of infection, being essential for physiological peritrichous flagellation, for motility, and for the secretion of virulence proteins. Among these proteins, we found that the L2 component of hemolysin BL, one of the most powerful toxins B. cereus produces, was drastically reduced by the FlhF depletion. Herein, we demonstrate that B. cereus FlhF forms GTP-dependent homodimers in vivo since the replacement of residues critical for their GTP-dependent homodimerization alters this ability. The protein directly or indirectly controls flagellation by affecting flagellin-gene transcription and its overproduction leads to a hyperflagellated phenotype. On the other hand, FlhF does not affect the expression of the L2-encoding gene (hblC), but physically binds L2 when in its homodimeric form, recruiting the protein to the plasma membrane for secretion. We additionally show that FlhF overproduction increases L2 secretion and that the FlhF/L2 interaction requires the NG domain of FlhF. Our findings demonstrate the peculiar behavior of B. cereus FlhF, which is required for the correct flagellar pattern and acts as SRP-GTPase in the secretion of a bacterial toxin subunit

RNA Interference To Knock Down Endothelial Von Willebrand Factor Protects Against Endothelial Infection By SARS-CoV-2

Background: Long-Coronavirus Disease-19 (COVID19) endotheliopathy is related to high levels of endothelial von Willebrand Factor (vWF). However, the role of vWF in regulating the susceptibility of endothelial cells to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS CoV 2) infection is still unknown. We hypothesized that targeting endothelial vWF with short interference RNA (siRNA) may prevent SARS CoV 2 entry into endothelial cells through angiotensin converting enzyme 2 (ACE2). Method: Gene silencing of vWF or ACE2 was performed in Human Umbilical Vein Endothelial cells (HUVECs) by short interfering RNA (siRNA), while vWF overexpression was obtained by transient pcDNA3.1-WT-VWF plasmid transfection of endothelial cells. The expression of ACE2 and vWF in endothelial cells was measured by the aid of qRT-PCR. Fluorochrome-labeled antibodies were used as probes for surface detection of both endothelial proteins. Wild type and transfected HUVECs were incubated with SARS-CoV-2 for one hour, and the level of cell infection was assessed by qRT-PCR of viral RNA after 24-48 hours. Results: Effective siRNA-mediated knockdown of vWF in viable HUVECs halved the susceptibility to infection by SARS-CoV-2 (p=0.0058). Interestingly, endothelial vWF knockdown induced a downregulation of ACE2 expression on the same cell (p=0.0032) and a significant localization on cell surface. Conversely, vWF overexpression led to significant upregulation of surface ACE2 (p=0.028) and increased susceptibility of HUVECs to SARS-CoV-2 infection (p=0.0009). Conclusions: Our findings reveal a hitherto unsuspected role of vWF in susceptibility of endothelial cells to viral infection by modulating levels of ACE2. Our discovery might be helpful to design new RNA-based therapeutics to prevent long-term viral persistence of SARS-CoV-2 in endothelial cells

Gene silencing of endothelial von Willebrand factor reduces the susceptibility of human endothelial cells to SARS-CoV-2 infection

Mechanisms underlying vascular endothelial susceptibility to infection by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) are not fully understood. Emerging evidence indicates that patients lacking von Willebrand factor (vWF), an endothelial hallmark, are less severely affected by SARS-CoV-2 infection, yet the precise role of endothelial vWF in modulating coronavirus entry into endothelial cells is unknown. In the present study, we demonstrated that effective gene silencing by short interfering RNA (siRNA) for vWF expression in resting human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) significantly reduced by 56% the cellular levels of SARS-CoV-2 genomic RNA. Similar reduction in intracellular SARS-CoV-2 genomic RNA levels was observed in non-activated HUVECs treated with siRNA targeting angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), the cellular gateway to coronavirus. By integrating quantitative information from real-time PCR and high-resolution confocal imaging, we demonstrated that ACE2 gene expression and its plasma membrane localization in HUVECs were both markedly reduced after treatment with siRNA anti-vWF or anti-ACE2. Conversely, siRNA anti-ACE2 did not reduce endothelial vWF gene expression and protein levels. Finally, SARS-CoV-2 infection of viable HUVECs was enhanced by overexpression of vWF, which increased ACE2 levels. Of note, we found a similar increase in interferon-beta mRNA levels following transfection with untargeted, anti-vWF or anti-ACE2 siRNA and pcDNA3.1-WT-VWF. We envision that siRNA targeting endothelial vWF will protect against productive endothelial infection by SARS-CoV-2 through downregulation of ACE2 expression and might serve as a novel tool to induce disease resistance by modulating the regulatory role of vWF on ACE2 expression

Incorporation of Copper Nanoparticles on Electrospun Polyurethane Membrane Fibers by a Spray Method

Electrospinning is an easy and versatile technique to obtain nanofibrous membranes with nanosized fibers, high porosity, and pore interconnectivity. Metal nanoparticles (e.g., Ag, Cu, ZnO) exhibit excellent biocide properties due to their size, shape, release of metal ions, or reactive oxygen species production, and thus are often used as antimicrobial agents. In this study, a combined electrospinning/spray technique was employed to fabricate electrospun polyurethane membranes loaded with copper nanoparticles at different surface densities (10, 20, 25, or 30 mu g/cm(2)). This method allows particle deposition onto the surface of the membranes without the use of chemical agents. SEM images showed that polyurethane fibers own homogeneous thickness (around 650 nm), and that spray-deposited copper nanoparticles are evenly distributed. STEM-EDX demonstrated that copper nanoparticles are deposited onto the surface of the fibers and are not covered by polyurethane. Moreover, a uniaxial rupture test showed that particles are firmly anchored to the electrospun fibers. Antibacterial tests against model microorganisms Escherichia coli indicated that the prepared electrospun membranes possess good bactericidal effect. Finally, the antiviral activity against SARS-CoV-2 was about 90% after 1 h of direct contact. The obtained results suggested that the electrospun membranes possess antimicrobial activities and can be used in medical and industrial applications

Longitudinal Nitric Oxide Levels and Infections by Ultrastructure and Genotype in Primary Ciliary Dyskinesia

BACKGROUND: We hypothesized that differences in nasal nitric oxide (nNO) and fractional exhaled nitric oxide (FENO) relate to prognosis in primary ciliary dyskinesia (PCD). RESEARCH QUESTION: What is the relationship between baseline values and longitudinal evolution of nNO and FENO and ultrastructure, genotype, and respiratory infections in PCD? STUDY DESIGN AND METHODS: Prospective, longitudinal, single-center study in adults and children evaluated biannually for up to 10 years. We compared cross-sectional and longi-tudinal values of nNO and FENO in ultrastructural (inner dynein arm [IDA] and microtubular disorganization [MTD]) and genetic (CCDC39 and CCDC40) groups known to have worse pulmonary function with patients within the ultrastructural and genetic groups with a better prognosis. Linear mixed-effects models were used to evaluate longitudinal associations. RESULTS: One hundred forty-one patients with PCD underwent 1,014 visits. At enrollment, no differences were found in children in nNO or FENO between the IDA and MTD group and the other ultrastructural groups. In adults, nNO (P = .038) and FENO (P = .032) were significantly lower in the IDA and MTD group than in all other combined ultrastructural groups. FENO values were significantly lower in the CCDC39 and CCDC40 group than in the DNAH5 and DNAH11 combined genotype group (P = .033) and in all other genotypes (P = .032). The IDA and MTD group showed a significant decline in nNO with age (P < .01) compared with other ultrastructural groups who showed stable levels. The CCDC39 and CCDC40 group showed the steepest decline in nNO over time (P < .01) compared with all other genotypes. A higher nNO was associated with lower likelihood of any positive bacterial isolate from the lower respiratory tract (P = .008). Changes in FENO over time did not differ between structural groups or genotypes

One-step silver coating of polypropylene surgical mask with antibacterial and antiviral properties

Face masks can filter droplets containing viruses and bacteria minimizing the transmission and spread of respiratory pathogens but are also an indirect source of microbes transmission.A novel antibacterial and antiviral Ag-coated polypropylene surgical mask obtained through the in situ and one-step deposition of metallic silver nanoparticles, synthesized by silver mirror reaction combined with sonication or agitation methods, is proposed in this study.SEM analysis shows Ag nanoparticles fused together in a continuous and dense layer for the coating obtained by sonication, whereas individual Ag nanoparticles around 150 nm were obtained combining the silver mirror reaction with agitation. EDX, XRD and XPS confirm the presence of metallic Ag in both coatings and also oxidized Ag in samples by agitation. A higher amount of Ag nanoparticles is deposited on samples by sonication, as calculated by TGA. Further, both coatings are biocompatible and show antibacterial properties: coating by sonication caused 24 % and 40 % of bacterial reduction while coating by agitation 48 % and 96 % against S. aureus and E. coli, respectively. At 1 min of contact with SARS-CoV-2, the coating by agitation has an antiviral capacity of 75 % against 24 % of the one by sonication. At 1 h, both coatings achieve 100 % of viral inhibition. Nonetheless, larger samples could be produced only through the silver mirror reaction combined with agitation, preserving the integrity of the mask.In conclusion, the silver-coated mask produced by silver mirror reaction combined with agitation is scalable, has excellent physico-chemical characteristics as well as significant biological properties, with higher antimicrobial activities, providing additional protection and preventing the indirect transmission of pathogens

One-step silver coating of polypropylene surgical mask with antibacterial and antiviral properties

Face masks can filter droplets containing viruses and bacteria minimizing the transmission and spread of respiratory pathogens but are also an indirect source of microbes transmission. A novel antibacterial and antiviral Ag-coated polypropylene surgical mask obtained through the in situ and one-step deposition of metallic silver nanoparticles, synthesized by silver mirror reaction combined with sonication or agitation methods, is proposed in this study. SEM analysis shows Ag nanoparticles fused together in a continuous and dense layer for the coating obtained by sonication, whereas individual Ag nanoparticles around 150 nm were obtained combining the silver mirror reaction with agitation. EDX, XRD and XPS confirm the presence of metallic Ag in both coatings and also oxidized Ag in samples by agitation. A higher amount of Ag nanoparticles is deposited on samples by sonication, as calculated by TGA. Further, both coatings are biocompatible and show antibacterial properties: coating by sonication caused 24% and 40% of bacterial reduction while coating by agitation 48% and 96% against S. aureus and E. coli, respectively. At 1 minute of contact with SARS-CoV-2, the coating by agitation has an antiviral capacity of 75% against 24% of the one by sonication. At 1 h, both coatings achieve 100% of viral inhibition. Nonetheless, larger samples could be produced only through the silver mirror reaction combined with agitation, preserving the integrity of the mask. In conclusion, the silver-coated mask produced by silver mirror reaction combined with agitation is scalable, has excellent physico-chemical characteristics as well as significant biological properties, with higher antimicrobial activities, providing additional protection and preventing the indirect transmission of pathogens