Chitin Katabolismus in filamentösen Pilzen

Zusammenfassung in deutscher SpracheAbweichender Titel nach Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersChitin ist ein Polysaccharid, das aus N-Acetylglucosamineinheiten (GlcNAc) aufgebaut ist. Die N-Acetylglucosamineinheiten sind durch ß-1,4-glycosidische Bindungen verknüpft. Chitin ist neben Cellulose, das am weitesten verbreitete Polysaccharid. Es kommt im Exoskelett von Insekten und Krustentieren vor und ist auch ein wichtiger Bestandteil in Pilzzellwänden. Da sich Chitin in der Biosphäre nicht sichtbar anhäuft, müssen die großen Mengen die jährlich an Chitin produziert werden, auch effizient abgebaut werden. Bakterien und Pilze sind hauptverantwortlich für den Chitinabbau in der Natur, sie können Chitin als Nährstoffquelle nutzen. Der erste Schritt des Chitinabbaus wird von extrazellulären Enzymen ausgeführt, den Chitinasen. Chitinasen spalten das Polymer Chitin in kleinere Oligomere, bis hin zu Dimeren (Chitobiose). Danach wandeln N- Acetylglucosaminidasen das Dimer in 2 N-Acetylglucosamin-monomere um. Der Transport von GlcNAc in die Zelle und die katabolische Umwandlung von GlcNAc zu Fruktose-6-Phosphat ist bis jetzt nur in der humanpathogenen Hefe Candida albicans untersucht worden. In dieser Doktorarbeit wurde der GlcNAc-Katabolismus in filamentösen Pilzen erforscht. Der erste Teil dieser Ergebnisse ist in einer Publikation veröffentlicht bei der wir zeigen konnten, dass die Gene, die am GlcNAc Abbau beteiligt sind, in einem Cluster vorkommen. Wir entdeckten, dass dieser Cluster zusätzlich einen Transkriptionsfaktor enthält, der starke Homologie zu Ndt80 aus S. cerevisiae aufweist. Wir nannten diesen Transkriptionsfaktor, der in C. albicans nicht vorkommt, RON1 (regulator of N-acetylglucosamine catabolism 1). Wir konnten zeigen, dass RON1 essentiell für den GlcNAc Abbau in Trichoderma reesei ist. Eine Literatursuche ergab, dass Neurospora crassa einen Transkriptionsfaktor besitzt, der eventuell auch in der Regulierung des GlcNAc-Katabolismus involviert ist. Dieser heißt GRHL (grainy head like protein), sein Ortholog in T. reesei ist CSP2. Untersuchungen dieses Transkriptionsfaktors ergaben, dass CSP2 in T. reesei nicht im GlcNAc Abbau beteiligt ist. In einer zweiten Studie, die in dieser Arbeit vorgestellt wird, lag der Fokus auf dem GlcNAc-Katabolismus in N. crassa. Wachstumstests zeigten, dass im Gegensatz zu anderen Pilzen, z.B. Trichoderma, GlcNAc eine schlechte Kohlenstoffquelle für N. crassa ist. Es stellte sich heraus, dass GlcNAc sogar in der Gegenwart einer zusätzlichen Kohlenstoffquelle wachstumshemmend ist. Überraschenderweise war N. crassa aber in der Lage auf dem Polymer Chitin zu wachsen. Auf Chitin waren die GlcNAc-abbauenden Gene jedoch nicht exprimiert, obwohl GlcNAc starke Induktion der Katabolismusgene bewirkte. Unsere Daten lassen darauf schließen, dass der Zwischenschritt, der zur Produktion von Glucosamine-6-Phopshat führt und von DAM1 durchgeführt wird, einen Engpass im GlcNAc-Stoffwechsel in N. crassa darstellen könnte. Analysen von Knockout-Mutanten der GlcNAc-abbauenden Gene zeigten, dass der Deletionsstamm des GlcNAc-6-phosphat-Deaminase-Gens (dam1) den größten Wachstumsdefekt auf Medium mit GlcNAc aufweist. Überexpression des T. reesei dam1 Gens in dem N. crassa Wildtyp und dem -dam-1 Stamm ermöglichte die teilweise Wiederherstellung des Wachstums von N. crassa auf Medium mit GlcNAc. Das Wachstum war aber nicht vollständig wieder hergestellt, was darauf hindeutet, dass andere Aspekte oder Kombinationen aus mehreren Schritten verantwortlich für die beobachteten Effekte von GlcNAc in N. crassa sind. Ein weiteres Thema dieser Doktorarbeit waren Chitin-bindende Proteine die zur Familie der Cerato-Platanine (CPPs) gehören. CPPs sind kleine, sezernierte Proteine, die vier konservierte Cysteine besitzen. Diese Proteine kommen nur in filamentösen Pilzen vor und werden leicht von anderen Organismen erkannt, was zu Wechselwirkungen von Pilzen mit anderen Organismen führt, z.B. regen diese Wechselwirkungen die Induktion von Abwehrreaktionen in Pflanzen an. Es ist aber noch nicht bekannt, ob die Hauptfunktion der CPPs diese Wechselwirkungen sind, oder ob sie eher eine Rolle im Pilzwachstum spielen. CPPs haben mehrere biochemische Eigenschaften, die in dieser Kombination nicht in anderen Proteinen zu finden sind. Einerseits sind CPPs Kohlenhydrat-bindende Proteine und sind in der Lage Chitin und GlcNAc-Oligosaccharide zu binden. Andererseits können sie an hydrophoben/hydrophilen Oberflächen akkumulieren und formen Proteinschichten, z.B. auf der Oberfläche von wässrigen Lösungen und verändern dadurch die Lösungen und Oberflächen. Trichoderma atroviride und Trichoderma virens werden in der Landwirtschaft als biologisches Schädlingsbekämpfungsmittel verwendet. CPPs sind Schlüsselfaktoren für die Interaktion zwischen Trichoderma und Pflanzen. T. atroviride and T. virens sind Mykoparasiten, das heißt sie sind in der Lage andere Pilze anzugreifen und zu töten. Sie können aber auch direkt mit den Pflanzen interagieren, wodurch deren Abwehrreaktionssystem stimuliert wird und die Pflanzen dadurch widerstandsfähiger gegen Krankheitserreger werden. Nur zwei der drei CP-Gene sind stark exprimiert in Trichoderma (sm1/epl1 and sm2/epl2). Knockoutstämme dieser Gene wurden auf ihr Wachstum und ihre Entwicklung untersucht und auch auf ihre Trichoderma-Pflanzen Interaktionen getestet. Das Fehlen der Proteine SM1/ EPL1 und SM2/ EPL2 in T. virens und auch T. atroviride reduzierte die systemische Resistenz von Maiskeimlingen gegenüber dem pflanzenpathogenen Pilz Cochliobolus heterostrophus drastisch. Die Ergebnisse zeigten, dass T. virens im Allgemeinen einen effektiveren Pflanzenschutz als T. atroviride ermöglicht. Zusätzlich wurde festgestellt, dass obwohl die CP-Gene sm1/epl1 wesentlich stärker als sm2/ epl2 während Pilzwachstum induziert wurden, SM2/ EPL2 wichtiger als SM1/ EPL1 zur Förderung der Pflanzenabwehr istThe polysaccharide chitin consists of ß-(1-4) linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) subunits. It is the second most abundant biopolymer after cellulose with a natural turnover of at least 109 tons of chitin per year. In the biosphere, it is not only present in fungal cell walls, but also in the exoskeletons of protists and arthropods, e.g. insects and shrimps. Nonetheless, chitin does not visibly accumulate in the biosphere which is indicative for its efficient natural recycling by microbes. Bacteria and fungi are mainly responsible for the degradation of chitin in soil and can utilize chitin as nutrient source. The first step of chitin degradation is performed by extracellular enzymes called chitinases, which decompose the chitin polymer into shorter oligomers down to the level of dimers (chitobiose). Subsequently, N-acetylglucosaminidases convert the dimer chitobiose into GlcNAc monomers. Transport of GlcNAc into the cell and catabolic conversion of GlcNAc into fructose-6-phosphate has so far only been studied in the human pathogenic yeast Candida albicans, but had not been investigated in filamentous fungi yet. In this doctoral thesis, GlcNAc-catabolism was studied in filamentous fungi. The first part of these results contributed to a publication in which we could show that in filamentous fungi the genes involved in GlcNAc-catabolism are clustered. Importantly, this cluster contains an Ndt80-like transcription factor, which we called RON1 (regulator of N-acetylglucosamine catabolism 1) that is not present in C. albicans. We could show that RON1 is essential for GlcNAc-catabolism in the filamentous fungus Trichoderma reesei. A survey of the literature showed that the Neurospora crassa GRHL (grainy head like protein) transcription factor could also be involved in the regulation of GlcNAc-metabolism. Investigation of CSP2, the ortholog of GRHL in T. reesei, indicated that this transcription factor has other functions in the fungus T. reesei. In a second study that is presented in this work, I focused on GlcNAc-catabolism in N. crassa. Growth assays showed that, in contrast to other fungi, such as Trichoderma spp., GlcNAc is surprisingly a very poor carbon source for N. crassa. GlcNAc turned even out to be growth-inhibiting in the presence of other carbon sources. Nonetheless N. crassa was surprisingly still able to grow on chitin. In agreement with this puzzling finding, the genes encoding the enzymes for GlcNAc-catabolism were not expressed on chitin, but induced by GlcNAc. Our data suggested that the glucosamine-6-phophate-deaminase gene could be a bottleneck in GlcNAc-catabolism in N. crassa. Analysis of knockout mutants of the GlcNAc-catabolism cluster genes showed that the lack of GlcNAc-6-phosphate deaminase gene (dam1) completely abolished residual growth of N. crassa on GlcNAc containing medium, which can probably be attributed to deleterious effects of GlcNAc-6-phosphate. Overexpression of T. reesei dam1 in N. crassa wild-type and -dam-1 strains under control of the strong N. crassa promoter ccg1 restored growth on GlcNAc-containing medium only to the (low) N. crassa wild-type level, but not beyond that, which suggests that other aspects or combinations of several steps are rate-limiting for the failure of N. crassa to metabolize GlcNAc efficiently. Another topic of this doctoral thesis were chitin-binding proteins belong to the cerato-platanin protein family. Cerato-platanin proteins (CPPs) are small, secreted proteins with four conserved cysteines that are abundantly produced by filamentous fungi with all types of life-styles. These proteins appear to be readily recognized by other organisms and are therefore important factors in interactions of fungi with other organisms, e.g. by stimulating the induction of defense responses in plants. However, it is not known yet whether the main function of CPPs is associated with these fungal interactions or rather plays a role in fungal growth and development. CPPs seem to unify several biochemical properties that are not found in this combination in other proteins. On one hand CPPs are carbohydrate-binding proteins and are able to bind to chitin and N-acetylglucosamine oligosaccharides, on the other hand they are able to self-assemble at hydrophobic/hydrophilic interfaces and form protein layers e.g. on the surface of aqueous solutions, thereby altering the polarity of solutions and surfaces. In the fungal species Trichoderma atroviride and Trichoderma virens, which are used as biocontrol agents in agricultural applications, CPPs have been shown to be key factors for the beneficial Trichoderma-plant interaction. T. atroviride and T. virens are potent mycoparasites, i.e. they are able to attack and kill other fungi, but can also directly interact with plants, thereby stimulating their defense response systems and making them more resistant against pathogens. Since only two (sm1/epl1 and sm2/epl2) of the three genes encoding CPPs in T. virens and T. atroviride were found to be strongly expressed, gene knockout strains were analyzed with respect to fungal growth and development as well as in Trichoderma-plant interactions. The effect of the lack of SM1/EPL1 and SM2/EPL2 in T. virens/T. atroviride on inducing systemic resistance in maize seedlings, challenged with the plant pathogen Cochliobolus heterostrophus, was tested. The results showed that T. virens was in general a more effective plant protectant than T. atroviride and further, although interestingly the CP genes sm1/epl1 were substantially stronger induced than sm2/epl2 during fungal growth, SM2/EPL2 turned out to be more important than SM1/EPL1 for the promotion of plant protection.14