The Unconventional Xer Recombination Machinery of Streptococci/Lactococci

Homologous recombination between circular sister chromosomes during DNA replication in bacteria can generate chromosome dimers that must be resolved into monomers prior to cell division. In Escherichia coli, dimer resolution is achieved by site-specific recombination, Xer recombination, involving two paralogous tyrosine recombinases, XerC and XerD, and a 28-bp recombination site (dif) located at the junction of the two replication arms. Xer recombination is tightly controlled by the septal protein FtsK. XerCD recombinases and FtsK are found on most sequenced eubacterial genomes, suggesting that the Xer recombination system as described in E. coli is highly conserved among prokaryotes. We show here that Streptococci and Lactococci carry an alternative Xer recombination machinery, organized in a single recombination module. This corresponds to an atypical 31-bp recombination site (difSL) associated with a dedicated tyrosine recombinase (XerS). In contrast to the E. coli Xer system, only a single recombinase is required to recombine difSL, suggesting a different mechanism in the recombination process. Despite this important difference, XerS can only perform efficient recombination when difSL sites are located on chromosome dimers. Moreover, the XerS/difSL recombination requires the streptococcal protein FtsKSL, probably without the need for direct protein-protein interaction, which we demonstrated to be located at the division septum of Lactococcus lactis. Acquisition of the XerS recombination module can be considered as a landmark of the separation of Streptococci/Lactococci from other firmicutes and support the view that Xer recombination is a conserved cellular function in bacteria, but that can be achieved by functional analogs

The art of cellular communication: tunneling nanotubes bridge the divide

The ability of cells to receive, process, and respond to information is essential for a variety of biological processes. This is true for the simplest single cell entity as it is for the highly specialized cells of multicellular organisms. In the latter, most cells do not exist as independent units, but are organized into specialized tissues. Within these functional assemblies, cells communicate with each other in different ways to coordinate physiological processes. Recently, a new type of cell-to-cell communication was discovered, based on de novo formation of membranous nanotubes between cells. These F-actin-rich structures, referred to as tunneling nanotubes (TNT), were shown to mediate membrane continuity between connected cells and facilitate the intercellular transport of various cellular components. The subsequent identification of TNT-like structures in numerous cell types revealed some structural diversity. At the same time it emerged that the direct transfer of cargo between cells is a common functional property, suggesting a general role of TNT-like structures in selective, long-range cell-to-cell communication. Due to the growing number of documented thin and long cell protrusions in tissue implicated in cell-to-cell signaling, it is intriguing to speculate that TNT-like structures also exist in vivo and participate in important physiological processes

Three-Dimensional Analysis of a Viral RNA Replication Complex Reveals a Virus-Induced Mini-Organelle

Positive-strand RNA viruses are the largest genetic class of viruses and include many serious human pathogens. All positive-strand RNA viruses replicate their genomes in association with intracellular membrane rearrangements such as single- or double-membrane vesicles. However, the exact sites of RNA synthesis and crucial topological relationships between relevant membranes, vesicle interiors, surrounding lumens, and cytoplasm generally are poorly defined. We applied electron microscope tomography and complementary approaches to flock house virus (FHV)–infected Drosophila cells to provide the first 3-D analysis of such replication complexes. The sole FHV RNA replication factor, protein A, and FHV-specific 5-bromouridine 5'-triphosphate incorporation localized between inner and outer mitochondrial membranes inside ∼50-nm vesicles (spherules), which thus are FHV-induced compartments for viral RNA synthesis. All such FHV spherules were outer mitochondrial membrane invaginations with interiors connected to the cytoplasm by a necked channel of ∼10-nm diameter, which is sufficient for ribonucleotide import and product RNA export. Tomographic, biochemical, and other results imply that FHV spherules contain, on average, three RNA replication intermediates and an interior shell of ∼100 membrane-spanning, self-interacting protein As. The results identify spherules as the site of protein A and nascent RNA accumulation and define spherule topology, dimensions, and stoichiometry to reveal the nature and many details of the organization and function of the FHV RNA replication complex. The resulting insights appear relevant to many other positive-strand RNA viruses and support recently proposed structural and likely evolutionary parallels with retrovirus and double-stranded RNA virus virions

Genes but Not Genomes Reveal Bacterial Domestication of Lactococcus Lactis

BACKGROUND: The population structure and diversity of Lactococcus lactis subsp. lactis, a major industrial bacterium involved in milk fermentation, was determined at both gene and genome level. Seventy-six lactococcal isolates of various origins were studied by different genotyping methods and thirty-six strains displaying unique macrorestriction fingerprints were analyzed by a new multilocus sequence typing (MLST) scheme. This gene-based analysis was compared to genomic characteristics determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: The MLST analysis revealed that L. lactis subsp. lactis is essentially clonal with infrequent intra- and intergenic recombination; also, despite its taxonomical classification as a subspecies, it displays a genetic diversity as substantial as that within several other bacterial species. Genome-based analysis revealed a genome size variability of 20%, a value typical of bacteria inhabiting different ecological niches, and that suggests a large pan-genome for this subspecies. However, the genomic characteristics (macrorestriction pattern, genome or chromosome size, plasmid content) did not correlate to the MLST-based phylogeny, with strains from the same sequence type (ST) differing by up to 230 kb in genome size. CONCLUSION/SIGNIFICANCE: The gene-based phylogeny was not fully consistent with the traditional classification into dairy and non-dairy strains but supported a new classification based on ecological separation between "environmental" strains, the main contributors to the genetic diversity within the subspecies, and "domesticated" strains, subject to recent genetic bottlenecks. Comparison between gene- and genome-based analyses revealed little relationship between core and dispensable genome phylogenies, indicating that clonal diversification and phenotypic variability of the "domesticated" strains essentially arose through substantial genomic flux within the dispensable genome

Une technique très sensible pour la détection et la quantification de génomes viraux intégrés : cinétique de renaturation d'un sonde moléculaire marquée à l'iode 125

Dans le but de déterminer les mécanismes, ainsi que le site, d'intégration du génome du virus SV40 dans les chromosomes de fibroblastes humains transformés par ce virus, nous avons été amenés à développer une technique permettant de détecter et de quantifier les séquences de DNA viral, d'une part, dans des cellules de ce type et, d'autre part, dans des cellules somatiques hybrides obtenues par fusion entre des cellules de souris et des cellules humaines fibroblastiques transformées. Il était impératif de pouvoir travailler avec des quantités de cellules aussi petites que possible, afin de procéder à l'examen des génomes intégrés dans les plus brefs délais après le clonage des cellules. La méthode de base choisie a été celle de la cinétique de réassociation (RI - R2) en raison de sa très grande sensibilité potentielle. Pour conférer à cette technique une sensibilité et une maniabilité qui la rendent applicable à de très petites quantités de DNA cellulaire, nous avons axé notre effort sur la mise au point: - d'un dosage spectrofluorimétrique du DNA en présence de bromhydrate d'éthidium (R3). Cette méthode de dosage est très sensible. - d'une technique de détection du DNA réassocié utilisant l'endonucléase S1 d'Aspergillus oryzae, spécifique du DNA a simple chaîne (R4). - d'un marquage in vitro du DNA viral à l'iode 125 permettant d'obtenir des préparations de très haute activité spécifique (R5). Grâce à cette technique, améliorée par nous sur ces trois points, nous avons d'abord pu explorer la réassociation du DNA viral avec lui-même. Ainsi, avons-nous observé que: - la vitesse de réassociation d'un DNA uniformément marqué in vivo au phosphore 32 ou in vitro à l'iode 125 peut être précisément mesurée grâce au développement de la résistance à la digestion par la nucléase S1. Les Cot ½ sont indépendants de la concentration en DNA. - la déviation des données d'une cinétique idéale du second ordre représente probablement la lente réassociation des extrémités monocaténaires subsistant après la première étape de nucléation et d'appariement de deux brins séparés. Par des expériences de reconstruction, nous avons démontré la valeur de la méthode; il nous a été possible de détecter des séquences virales dans des lignées contenant moins d'un génome viral par cellule. Dans le département de microbiologie, ont été isolées un certain nombre de lignées cellulaires humaines transformées par SV40; ces cellules ont été fusionnées avec des cellules de rongeur et des deux types de lignées pour quantifier les séquences de DNA viral présentes: nous avons trouvé une lignée de fibroblastes humains contenant 1,9 génomes équivalents viraux par cellule et une lignée cellulaire hybride ayant 1,5 copie virale par cellule. Ces deux lignées, qui ne contiennent que peu de séquences virales et qui sont strictement non permissives, présentent des caractéristiques très intéressantes pour l'étude du site d'intégration du virus SV40 dans les chromosomes

Une technique très sensible pour la détection et la quantification de génomes viraux intégrés : cinétique de renaturation d'un sonde moléculaire marquée à l'iode 125

Dans le but de déterminer les mécanismes, ainsi que le site, d'intégration du génome du virus SV40 dans les chromosomes de fibroblastes humains transformés par ce virus, nous avons été amenés à développer une technique permettant de détecter et de quantifier les séquences de DNA viral, d'une part, dans des cellules de ce type et, d'autre part, dans des cellules somatiques hybrides obtenues par fusion entre des cellules de souris et des cellules humaines fibroblastiques transformées. Il était impératif de pouvoir travailler avec des quantités de cellules aussi petites que possible, afin de procéder à l'examen des génomes intégrés dans les plus brefs délais après le clonage des cellules. La méthode de base choisie a été celle de la cinétique de réassociation (RI - R2) en raison de sa très grande sensibilité potentielle. Pour conférer à cette technique une sensibilité et une maniabilité qui la rendent applicable à de très petites quantités de DNA cellulaire, nous avons axé notre effort sur la mise au point: - d'un dosage spectrofluorimétrique du DNA en présence de bromhydrate d'éthidium (R3). Cette méthode de dosage est très sensible. - d'une technique de détection du DNA réassocié utilisant l'endonucléase S1 d'Aspergillus oryzae, spécifique du DNA a simple chaîne (R4). - d'un marquage in vitro du DNA viral à l'iode 125 permettant d'obtenir des préparations de très haute activité spécifique (R5). Grâce à cette technique, améliorée par nous sur ces trois points, nous avons d'abord pu explorer la réassociation du DNA viral avec lui-même. Ainsi, avons-nous observé que: - la vitesse de réassociation d'un DNA uniformément marqué in vivo au phosphore 32 ou in vitro à l'iode 125 peut être précisément mesurée grâce au développement de la résistance à la digestion par la nucléase S1. Les Cot ½ sont indépendants de la concentration en DNA. - la déviation des données d'une cinétique idéale du second ordre représente probablement la lente réassociation des extrémités monocaténaires subsistant après la première étape de nucléation et d'appariement de deux brins séparés. Par des expériences de reconstruction, nous avons démontré la valeur de la méthode; il nous a été possible de détecter des séquences virales dans des lignées contenant moins d'un génome viral par cellule. Dans le département de microbiologie, ont été isolées un certain nombre de lignées cellulaires humaines transformées par SV40; ces cellules ont été fusionnées avec des cellules de rongeur et des deux types de lignées pour quantifier les séquences de DNA viral présentes: nous avons trouvé une lignée de fibroblastes humains contenant 1,9 génomes équivalents viraux par cellule et une lignée cellulaire hybride ayant 1,5 copie virale par cellule. Ces deux lignées, qui ne contiennent que peu de séquences virales et qui sont strictement non permissives, présentent des caractéristiques très intéressantes pour l'étude du site d'intégration du virus SV40 dans les chromosomes

Le module de lysogénie du bactériophage mv4 de Lactobacillus delbrueckiis (le commutateur génétique et le contrôle directionnel de la recombinaison spécifique de site)

TOULOUSE3-BU Sciences (315552104) / SudocSudocFranceF